Development of novel disinfection methods to control microbial contamination in fresh foods = 신선 식품 내 미생물 오염 제어를 위한 신규 살균 기술 개발|RISS 상세보기

국문 초록 (Abstract)

전 세계적으로 신선 과일 및 채소 시장은 계속해서 빠른 속도로 성장하고 있다. 이러한 신선 식품 시장의 성장과 함께 이를 구매하는 소비자들은 더욱 신선하고 건강하고 위생적이며 안전한 식품을 선호하고 있다. 하지만, 현재 신선 채소 및 신선 과채 주스를 비롯한 다양한 신선 식품에서 병원성 박테리아의 지속적인 검출로 인한 식중독 사고 문제가 심각한 실정이다. 또한, 항생제 내성균(antibiotic resistant bacteria, ARB)으로부터 병원성균으로 항생제 내성 유전자(antibiotic resistance genes, ARGs)의 수평적 유전자 이동(horizontal gene transfer, HGT)에 따라 다양한 항생제에 대하여 내성을 획득한 슈퍼박테리아라고 불리는 다제내성균의 출현이 가장 큰 문제가 되고 있다. 따라서 이를 해결하기 위하여 현재 식품 산업에서는 다양한 물리, 화학적 처리 기술을 적용하여 병원성 세균을 우수하게 제어하고 있지만 고열과 같은 과도한 물리적 처리는 식품의 물성이나 색도에 영향을 미쳐 식품의 품질 저하를 야기할 수 있다. 또한, 화학적 처리의 경우에는 염소와 같은 잔류 물질들에 의한 독성 및 냄새를 유발하여 인간의 섭취 또는 흡입으로 인한 심각한 문제를 야기할 수 있다. 따라서 본 연구에서는 항생제 내성 및 식중독 균의 오염을 효과적으로 제어할 수 있는 새로운 물리적 및 생물학적 살균 방법을 개발하고 이를 실제 신선 식품에 적용 및 평가하는 것을 목표로 연구를 수행하였다.
먼저 항생제 내성 박테리아(ARB)와 항생제 내성 유전자(ARGs)를 모두 효과적으로 제어하기 위하여 초음파를 기반으로 한 물리적 병용 처리 기술을 개발하고 이를 두 종류의 신선 식품에 적용하였다. 항생제는 여러 전염병을 치료하기 위하여 널리 사용되었다. 하지만 이러한 항생제의 남용으로 인하여 식품산업을 비롯한 다양한 분야에서 항생제 내성균(ARB)의 출현과 이들의 확산이 촉진되고 있다. 따라서 본 연구에서는 ARB에 대한 새로운 제어 전략을 개발하기 위하여 두가지 기존 살균 방법인 온화한 열(mild heat) 및 초음파(sonication) 처리의 항균 효능을 평가하고 이를 최적화하였다. 온화한 열 및 초음파(mild heat and sonication, HS)를 동시에 처리하면 항생제 내성 대장균(antibiotic resistant Escherichia coli)의 생존 세포 수가 크게 감소하여 처리 4분 만에 5.58-log의 감소를 달성하는 것을 확인하였다. 하지만 개별적으로 각각 처리된 그룹에서 생존 세포 수의 현저한 감소는 관찰되지 않았다. 흥미롭게도 항생제 내성 유전자(ARGs)의 방출은 열 단독 처리 그룹과 HS 병용 처리 그룹에서 처리 시간에 따라 의존적으로 증가하였다. HS 처리 시간이 2분에서 8분으로 증가함에 따라 ARGs의 불활성화 수준이 증가하였고, 대부분의 ARGs는 처리 6분 후에 분해되어 불활성화되었다. 반면, 열 또는 초음파의 단독 처리 그룹에서는 처리 8분 후에도 ARGs의 유의한 불활성화가 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 ARB뿐만 아니라 ARGs의 제어에 있어서 HS 병용 처리의 시너지 효과를 나타낸다. 마지막으로 신선식품(방울 토마토 및 당근주스) 상에 새롭게 개발된 병용처리(HS)를 적용하였을 때 각각 3.97-log 및 4.28-log의 ARB 불활성화를 달성하였으며, 해당 병용 처리(HS)는 4℃에서 5일 동안의 보관 기간 동안 식품의 품질(색도 및 물성)에 부정적인 영향을 미치지 않았다. 또한, HS 처리는 두 가지의 신선 식품 시스템에서도 ARGs를 효과적으로 불활성화 하였다. 이는 식품 산업, 특히 최소 가공 식품을 준비하는 데 해당 물리적 병용 처리 기술의 잠재적인 적용 가능성을 보여준다.
다음으로, 본 연구에서는 미생물의 오염에 대한 생물학적 살균 방법으로서 환경 샘플로부터 새로운 박테리오파지(bacteriophage)를 분리하고 이의 형태학적, 생물학적, 그리고 유전학적인 특성 분석을 진행하였으며 이를 실제 신선 식품에 적용하고 황색포도상구균의 오염을 효과적으로 제어하고자 하였다. 최근 국내에서는 녹색 잎 채소에서 황색포도상구균이 지속적으로 검출되고 있는 실정이다. 황색포도상구균은 전 세계적으로 주요한 식중독 균 중 하나로, 인간과 동물에서 다양한 감염을 일으키는 그람 양성 박테리아이다. 항생제의 광범위한 사용은 메티실린 내성 황색포도상구균(methicillin resistant Staphylococcus aureus; MRSA)의 출현을 야기하였다. 따라서 본 연구에서는 황색포도상구균 병원체에 대한 천연 항균제로서 용균성 박테리오파지를 유입 하수로부터 분리하고 SSP49로 명명하였다. 특히 새롭게 분리된 해당 SSP49 파지는 높은 숙주 특이성으로 인하여 S. aureus ATCC 13301 표적 균주를 30시간 동안 지속적으로 제어하였다. SSP49는 형태학적으로 Myoviridae family로 분류되었으며 이중 가닥 DNA genome을 포함하고 있는 것으로 나타났다. 또한, SSP49의 genome은 총 191개의 ORFs (open reading frames)를 포함하는 137,283 bp (30.01% G+C)이었으며, 숙주 세포의 용해에 중요한 역할을 하는 lysin 및 holin 단백질 관련 유전자를 가지고 있는 것으로 확인되었다. Lysogeny와 관련된 유전자, 독성 관련 유전자 및 항생제 내성과 관련된 유전자는 확인되지 않아 식품 적용에 있어 안전한 파지라고 판단되었다. SSP49는 다양한 종류의 황색포도상구균에 대하여 넓은 숙주 범위와 높은 EOP (efficiency of plating)를 보여주었다. 특히, 높은 온도 범위 및 다양한 pH 조건에서 SSP49 파지의 활성은 상당히 안정적이었다. 마지막으로, 실제 신선 식품 (어린 잎 시금치) 표면에서 해당 SSP49 파지 처리 이후 4°C 및 25°C의 보관 조건에서 24시간까지 황색포도상구균을 효과적으로 제어하였으며, SSP49 파지의 활성 또한 높게 유지되었다. 따라서 본 연구를 새롭게 분리된 SSP49 파지는 신선 식품에서의 황색포도상구균 오염에 대한 유망한 생물학적 제제로서 사용될 수 있을 것이라 생각된다.
본 연구를 종합하면, 다양한 종류의 신선 식품에서의 항생제 내성 및 주요 식중독 균 중 하나인 황색포도상구균의 오염을 효과적으로 제어하기 위하여 새로운 물리적 병용 처리 기술 및 생물학적 제제로서 박테리오파지를 새롭게 분리하고 이를 특성화 하는 연구를 수행하였다. 본 연구를 통해 새롭게 개발된 물리적 및 생물학적 신규 살균 기술은 향후 실제 식품 산업에서 기존의 다양한 처리 기술들을 대체할 수 있을 것이라 판단되며, 이와 같은 미생물의 오염을 더욱 효과적으로 제어하면서도 식품의 품질에는 부정직인 영향을 미치지 않는 유망한 살균 기술로서 잠재적으로 활용될 수 있을 것이다.

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전 세계적으로 신선 과일 및 채소 시장은 계속해서 빠른 속도로 성장하고 있다. 이러한 신선 식품 시장의 성장과 함께 이를 구매하는 소비자들은 더욱 신선하고 건강하고 위생적이며 안전한...

목차 (Table of Contents)

I. Effective control of antibiotic resistance using a sonication based combinational treatment and its application to fresh foods
1. Introduction 1
2. Materials and methods 4
2.1. Reagents 4

I. Effective control of antibiotic resistance using a sonication based combinational treatment and its application to fresh foods
1. Introduction 1
2. Materials and methods 4
2.1. Reagents 4
2.2. Bacterial strains, plasmids, culture methods, and bacterial enumeration 4
2.3 Assessment of antimicrobial efficacy and nucleic acid release 5
2.3.1. Antimicrobial efficacy test 5
2.3.2. Nucleic acid release assay 6
2.4. Inactivation of ARGs 7
2.4.1. Assessment of nucleic acid cleavage by agarose gel electrophoresis 7
2.4.2. Assessment of nucleic acid integrity by heat shock transformation 8
2.5. Food application 8
2.5.1. Inactivation of ARB in fresh food 8
2.5.2. Inactivation of ARGs in fresh food 9
2.6. Food quality analysis 10
3. Results and discussion 12
3.1. Microbial inactivation efficacy 12
3.2. Nucleic acid release 16
3.3. Agarose gel electrophoresis 22
3.4. HGT efficacy 26
3.5. Inactivation of ARB in fresh food 31
3.6. Inactivation of ARGs in fresh food 35
3.7. Evaluation of color and firmness 38
4. Conclusion 45
II. Isolation, characterization of a novel lytic bacteriophage SSP49 and its application on baby spinach leaves to control of Staphylococcus aureus contamination
1. Introduction 47
2. Materials and methods 51
2.1. Bacterial strains, media, and culture conditions 51
2.2. Isolation, purification, and propagation of bacteriophage 51
2.3. Characterization of the isolated bacteriophage 52
2.3.1. Bacterial challenge assay 52
2.3.2. Morphological analysis of the bacteriophage 53
2.3.3. Host range analysis 54
2.3.4. Host receptor analysis and complementation 57
2.3.5. Bacteriophage genome DNA extraction 57
2.3.6. Whole genome sequencing (WGS) 58
2.3.7. Thermal and pH stability test 58
2.4. Food application 59
2.4.1. Preparation of fresh food, inoculation of bacteria, and bacteriophage treatment 59
2.4.2. Recovery of bacteria 60
2.4.3. Recovery of phage 60
3. Results and Discussion 61
3.1. Bacterial challenge assay 61
3.2. Morphological analysis of phage SSP49 64
3.3. Host range analysis of phage SSP49 66
3.4. Host receptor analysis of phage SSP49 67
3.5. Whole genome sequencing (WGS) 69
3.6. Thermal and pH stability 73
3.7. Control of microbial contamination in fresh food 76
4. Conclusion 82
References 84
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