Peroxidase 활성에 의한 ROS 탐침의 산화 = Oxidation of ROS probes by peroxidase activity|RISS 상세보기

국문 초록 (Abstract)

세포들은 정상적인 신진대사뿐만 아니라 pathological 상태에서 활성산소종(ROS)과 활성질소종(RNS)을 생성한다. 따라서 ROS와 RNS의 정확한 정량은 세포의 생리기능을 이해하기 위해서 중요하다. 2’, 7’-dichlorodihydrofluorescein(DCFH₂)와 dihydrorhodamine-123(DHR-123)은 ROS와 RNS를 측정하는 탐침으로 널리 사용하고 있으며, 이 두 물질은 산화에 의해서 강한 형광을 가지게 된다. 그러나 ROS와 RNS에 의해 탐침이 산화되는 상세한 mechanism은 아직 밝혀져 있지 않다. 우리는 세포들 내에서 생성되는 주요 ROS와 RNS인 hydrogen peroxide(H₂O₂), superoxide(O₂??), nitric oxide(NO?), 그리고 peroxynitrite(ONOO-)와 탐침의 반응을 관찰하였다. Peroxynitrite만이 DCFH₂와 DHR-123을 직접 산화시켰다. Hydrogen peroxide는 단백질이 존재하고 peroxidase 활성이 있을시에만 탐침을 산화시켰다. Horseradish peroxidas(HRP)는 가장 효과적인 촉매제이다. Cytochrome c는 탐침의 peroxidatic 산화에 좋은 촉매제이고, peroxynitrite가 처리되었을 때 활성이 증가된다. HRP의 Compound Ⅰ 과 Ⅱ는 탐침을 산화 시킬 수 있으며, cytochrome c에서는 매우 불안정하다. 마지막으로 우리는 탐침의 산화에서 항산화제의 효능을 조사하였다. Peroxynitrite만이 catechin과 quercetin을 직접 산화시켰다. 항산화제는 다른 ROS와 RNS를 제거하는데 효과적이지 않다. 그 대신 그들은 탐침에 대한 peroxidase 활성과 경쟁하여 탐침의 산화를 저해한다.

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세포들은 정상적인 신진대사뿐만 아니라 pathological 상태에서 활성산소종(ROS)과 활성질소종(RNS)을 생성한다. 따라서 ROS와 RNS의 정확한 정량은 세포의 생리기능을 이해하기 위해서 중요하다. 2...

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Cells produce reactive oxygen and nitrogen species (ROS and RNS) not only during normal metabolism but under pathological conditions. Thus accurate quantitation of ROS and RNS is crucial for understanding the cellular physiology. The two most widely used probes for ROS and RNS are 2’,7’-dichlorodihydrofluorescein (DCFH₂) and dihydrorhodamine-123 (DHR-123), both of which become strongly fluorescent upon oxidation. However, a detailed mechanism by which ROS and RNS oxidize the probes is not identified yet. We reacted the probes with hydrogen peroxide, superoxide, nitric oxide, and peroxynitrite, the major ROS and RNS produced within cells. Peroxynitrite was the only species that could directly oxidize both DCFH₂ and DHR-123. Hydrogen peroxide oxidized the probes only in the presence of proteins and chemical species with a peroxidase activity. Horseradish peroxidase (HRP) was by far the most efficient catalyst. Cytochrome c was a good catalyst for the peroxidatic oxidation of the probes and its activity was greatly enhanced when treated with peroxynitrite. Both Compounds I and II of HRP were able to oxidize the probes although they were too unstable to be detected in cytochrome c. Finally we examined the effect of antioxidants on the probe oxidation. Only peroxynitrite could directly oxidize catechin and quercetin. The antioxidants could not efficiently scavenge the other ROS and RNS. Instead they inhibited the probe oxidation by competing for the peroxidase activity with the probes.

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목차 (Table of Contents)

Ⅰ. 서론 = 2
Ⅱ. 재료 및 실험방법 = 5
A. 실험재료 = 5
B. 실험방법 = 6
1. Peroxynitrite 처리에 의한 cytochrome c의 니트로화 = 6

Ⅰ. 서론 = 2
Ⅱ. 재료 및 실험방법 = 5
A. 실험재료 = 5
B. 실험방법 = 6
1. Peroxynitrite 처리에 의한 cytochrome c의 니트로화 = 6
2. DCFH-DA/DHR-123의 가수분해 = 6
3. Peroxidase activity 측정 = 6
4. Guamidine hydrochloride에 의한 단백질의 unfolding = 7
5. HRP Compound I and II = 7
6. 세포 배양 및 cell lysis = 7
Ⅲ. 결과 및 토론 = 8
1. DCFH2/DCF와 DHR-123/RH-123의 흡광 스펙트럼 및 형광 스펙트럼 = 8
2. ROS/RNS 자체에 의한 탐침의 산화 = 9
3. CuZnSOD, cytochrome c(Cc), Nitrited cytochrome c(Cc-PN), HRP, Hemin의 peroxidase 활성에 의한 DCFH2 와 DHR-123의 산화 = 10
4. 항산화제(Catechin, Quercetin)자체와 ROS/RNS의 반응 = 12
5. Peroxidase 활성에 의한 항산화제의 산화 = 13
6. Peroxidase활성에 의한 DCFH2/DHR-123의 산화에서 항산화제에 의한 억제 = 14
7. Compound I 과 II에 의한 DCFH2와 항산화제의 산화 = 15
Ⅳ. 결론 = 29
Ⅴ. 참고문헌 = 30
Abstract = 34

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