Chinese Hamster Ovary (CHO) cells are widely utilized in the production of recombinant biopharmaceuticals due to their suitability for large-scale commercial manufacturing. Because the composition of the culture medium critically influences cell growth and productivity, it is essential to develop medium formulations optimized for specific cell lines. Recently, the development of chemically defined media (CDM), in which all components are clearly specified, has gained increasing importance. CDM provides a consistent culture environment, eliminates the use of animal-derived materials, and thereby minimizes the risk of viral contamination, making it advantageous for quality control and regulatory compliance. In this study, a Design of Experiment (DoE) approach was employed to efficiently optimize the component concentrations of a CDM formulation for CHO-DG44 cells. To accelerate the optimization of numerous medium components, both basal and feed media were divided into five groups according to the physicochemical characteristics of their components, and DoE was conducted on these five grouped factors. For basal medium optimization, a Fractional Factorial Design (FFD) was applied directly without a preceding Plackett–Burman Design (PBD), since the number of factors was significantly reduced through grouping. Subsequently, a Central Composite Design (CCD) was implemented for further optimization, resulting in a 158% increase in Peak Viable Cell Density (PVCD) compared with the initial medium formulation. For feed medium optimization, an FFD was also conducted for the five grouped factors, yielding a 146% improvement in PVCD and a 400% increase in antibody titer compared with batch culture. Collectively, these results demonstrate the successful development of basal and feed media capable of supporting enhanced cell growth and productivity in fed-batch CHO cell cultures. Basal medium for CHO‑DG44 cultivation often contains poorly soluble amino acids such as tyrosine, requiring acidic or additive-assisted dissolution, and cystine, which remains nearly insoluble at neutral pH and can precipitate feed media, reduce cysteine bioavailability, and compromise formulation stability. To address these challenges, a Design of Experiments (DoE) approach was used to develop basal and feed media whereby highly soluble dipeptides replaced or supplemented L‑tyrosine and L‑cystine in this study. Media performance was assessed through viable cell density (VCD), viability, and recombinant protein titer, while critical quality attributes of charge variant distribution and aggregation were monitored to ensure product integrity. In this study, replacement experiments were conducted by gradually increasing the proportion of dipeptides in place of free amino acid forms of tyrosine and cystine in the basal medium. When L-tyrosine was replaced with GY and AY dipeptides, viable cell density (VCD) comparable to or higher than that of the control was observed, indicating that these dipeptides can support early cell growth. This effect is considered to be related to the uptake and utilization characteristics of GY and AY dipeptides. In contrast, replacement of L-cystine with AC and KC dipeptides resulted in similar or lower VCD compared to the control, suggesting limitations in supporting early cell growth. Based on these observations, L-tyrosine dipeptides can be considered effective alternatives in the basal medium, whereas partial replacement of L-cystine is more appropriate than complete substitution. Subsequently, experiments were conducted in the feed medium to replace free amino acids with dipeptide forms or to eliminate problematic amino acids. To address limitations associated with high-concentration fed-batch culture media, the total amount of amino acids supplied through the feed medium during the culture period was calculated and supplemented in advance into the basal medium in the form of dipeptides, while the corresponding amino acids were excluded from the feed medium. The results showed that tyrosine dipeptides supported cell growth, whereas cystine dipeptides contributed to improvements in cell-specific productivity. These findings indicate that differences in dipeptide transport and enzymatic cleavage characteristics can influence cellular responses. Overall, the use of dipeptides represents a feasible approach to mitigating solubility and stability issues in high-concentration fed-batch culture media and provides an effective strategy for improving biopharmaceutical production.

Chinese Hamster Ovary (CHO) cell은 대규모 상업적 생산에 적합하여, 현재 재조합 바이오의약품 분야에서 널리 사용되고 있다. 세포 배양에 이용되는 배양 배지의 경우 세포 성장과 생산에 중요한 영향을 미치기 때문에 세포주마다 적합한 배지를 개발하는 것이 필요하다. 최근에는 모든 조성이 정의되어 있는 Chemically Defined Media (CDM) 개발이 중요해지고 있다. CDM 배지는 성분 인자가 명확하기 때문에 일관된 세포 배양 환경 제공이 가능하고, 동물 유래 성분을 사용하지 않아 바이러스 오염 위험이 낮아 품질 관리 및 규제에 적합하다. 본 연구에서는 Design of Experiment (DoE)를 사용하여 효율적으로 CHO-DG44에 대한 CDM 성분 인자 농도 최적화를 진행하였다. 더 빠르게 많은 성분 인자를 최적화하기 위해, Basal media와 feed media 모두 수십 가지의 배지 성분을 각 성분 인자의 특성에 맞게 5개로 그룹화하여 5개의 인자에 대해 DoE를 진행하였다. 먼저 basal media의 경우, 그룹화를 통해 인자 수를 크게 줄였기 때문에 Screening 단계에서 Placket-Burman Design (PBD)를 진행하지 않고, Fractional Factorial Design (FFD)를 진행하였다. 이어서 optimization을 위해 Central Composite Design (CCD)를 진행하여 초기 배지 대비 최종적으로 158% 증가한 Peak Viable Cell Density (PVCD)를 얻어 성공적으로 배지 개발을 진행하였다. Feed media 또한 5개의 인자에 대해 Fractional Factorial Design (FFD)를 진행하였고, batch culture와 비교하여 146% 증가한 PVCD와 400% 증가한 antibody titer를 얻어 fed-batch culture에서 성장 및 생산 지원 가능한 feed media를 개발하였다. CHO-DG44 세포 배양에 사용되는 media에는 잘 녹지 않는 아미노산이 포함 되어 있다. tyrosine은 알칼리성 조건이나 첨가제를 이용해야 용해할 수 있으 며, cystine은 중성 pH에서 거의 녹지 않아 feed 배지에서 침전이 생길 수 있 고, 이에 따라 시스테인의 이용률을 떨어뜨리며 제형 안정성에도 문제를 일으킬 수 있다. 이러한 한계를 해결하기 위해 본 연구에서는 앞서 개발한 basal 배지와 feed 배지에 포함된 L- tyrosine과 cystine을 용해도가 높은 dipeptides로 대체하 거나 보완하였다. 배지 성능은 생존 세포 밀도(VCD), 세포 생존율, 그리고 재 조합 단백질 생산량으로 평가되었으며, product의 quality를 보장하기 위해 charge variant와 aggregation과 같은 critical quality attributes(CQA)도 함 께 모니터링하였다. basal medium에서 free amino acid 형태의 tyrosine과 cystine를 각각의 dipeptides로 비율을 점차 높여 대체 실험을 진행하였다. L-tyrosine을 GY (Glycyl-L-tyrosine)및 AY (Alanyl-L-tyrosine) dipeptides로 대체한 조 건에서는 control과 유사하거나 높은 VCD를 나타내어 초기 세포 성장 지원이 가능함을 확인하였다. 이는 GY 및 AY dipeptides의 빠른 흡수 및 이용 특성과 관련된 것으로 판단된다. 반면 L-cystine을 AC (Alanyl-L-cystine) 및 KC (Lysyl-L-cystine) dipeptides로 대체한 경우에는 흡수 속도가 느려 control 대비 유사하거나 낮은 VCD를 보였으며, 초기 세포 성장 측면에서는 한계를 나 타냈다. 이러한 결과를 종합하면, L-tyrosine dipeptides는 basal medium에 서 효과적인 대체원이 될 수 있는 반면, L-cystine의 경우 완전 대체보다는 부 분 대체 전략이 적합할 것으로 판단된다. 다음으로는 feed medium에서 free amino acid 형태를 dipeptides 형태로 대 체하는 실험을 진행하였고, 다른 하나는 feed medium에서 문제가 되는 아미노 산을 제거하고자 하였다. 이를 위해 배양 기간 동안 첨가되는 feed medium 내 해당 아미노산 농도를 계산하여 dipeptides 형태로 미리 basal medium에 첨가 하고, feed medium에서는 해당 아미노산을 제거하는 조건을 진행하여 고농축 배양 배지에서의 한계를 해결하고자 하였다. 실험 결과 tyrosine dipeptides는 세포 성장률을, cystine dipeptides는 세포 특이적 생산성을 상대적으로 향상시 키는 경향을 보였다. 이는 dipeptides 수송 및 효소적 절단 특성 차이에 따른 결과로, 동일 아미노산 유래 dipeptides라 하더라도 적용 목적에 따라 선택적 사용이 필요함을 시사한다. 전반적으로 본 연구에서는 dipeptides 사용이 high concentration fed-batch 배양 배지에서 발생하는 용해도와 안정성 문제를 해결할 수 있는 발전 가능성 있는 전략임을 보여주며, 효율적인 바이오의약품 생산을 위한 새로운 접근을 제 시하였다.

• 1. Introduction 1
• 2. Materials and Methods 9
• 2.1 Cell line and culture conditions 9
• 2.2 Measurement of viable cell density and viability 9
• 2.3 Analysis of metabolism 9
• 2.4 Culture media preparation 10
• 2.5 Antibody purification 11
• 2.6 Charge variants and aggregates analysis 12
• 3. Results 13
• 3.1 Basal media development 13
• 3.1.1 Fractional Factorial Design (FFD) 13
• 3.1.2 Central Composite Design (CCD) 16
• 3.2 Feed media development 20
• 3.2.1 Fractional Factorial Design (FFD) 20
• 3.3 Dipeptides 23
• 3.3.1 Dipeptides Substitution in Basal Medium 23
• 3.3.2 Dipeptides Substitution in Feed Medium 36
• 4. Conclusion and Discussion 49
• 5. References 52