Regulation of T helper cell responses by costunolide via down-regulation of dendritic cells' maturation

장숙정 Graduate School, Korea University 2014 국내석사

Costunolide, a germacranolide sesquiterpene lactone which is one of the active ingredients in several medicinal plants, is well known with their potent anti-cancer, anti-microbial, anti-fungal and anti-inflammatory properties. Costunolide has the ability to inhibit the production of nitric oxide (NO) and pro-inflammatory cytokines, such as tumor necrosis factor-a (TNF)-a, interleukin (IL)-6 and IL-1b in addition to their suppression on the activation of nuclear factor (NF)-kB and mitogen-activated protein kinase (MAPK) on macrophages. However, the effects of costunolide on dendritic cells (DCs) yet remain to be elucidated. In this study, I determined the effects of costunolide on the maturation and activation of lipopolysaccharide (LPS)-stimulated DCs by determining the expression of cell surface molecules, their cytokine expression and production, as well as T helper (Th) cell responses. Costunolide significantly down-regulated the expression level of cell surface molecules such as CD40, co-stimulatory molecules (CD80 and CD86), and MHC class II. Moreover, costunolide also inhibited the expression and the production of several cytokines on DCs. At the same time, costunolide-treated DCs also inhibited CD4+ T cells proliferation in the presence of antigen by decreasing IL-2-expressing cells. Furthermore, costunolide-treated DCs inhibited LPS-induced IFN-gproduction while increased the production of IL-4 and IL-17 in CD4+ T cells. The production of IFN-g was restored after IL-12 treatment. These findings demonstrate that costunolide could effectively inhibits LPS-induced maturation of DCs, and in the meantime, regulates Th responses by attenuates Th1 via the reduction of IL-12 production and enhances Th2 and Th17 on CD4+ T cells. Thus, costunolide may be able to exhibit its therapeutic use, especially in Th1-mediated immune diseases.

Comprehensive Immunological Investigation for Non-responders With Annual Influenza Vaccination

Eun Ju Jung 고려대학교 대학원 2024 국내박사

Influenza vaccines play a crucial role in mitigating the incidence of influenza virus infections and subsequent complications. However, due to the annual antigenic drift of influenza viruses, annual vaccination with the selected strains that reflect the anticipated circulating viruses is advised. The effectiveness of the vaccine can vary based on the recipient's immune status, prior vaccination history, vaccine type, manufacturing process, and degree of antigenic matching with the prevalent strain of the year. To enhance the immunogenicity of influenza vaccines, high-dose, adjuvanted, and recombinant vaccines have been developed. This study aimed to assess humoral and cellular immune responses in recipients of the influenza vaccine. Sixty healthy participants were vaccinated for the 2021–2022 season, and blood samples were collected pre- and post-vaccination. Immune responses were analyzed using the hemagglutination inhibition (HI) assay, B cell enzyme-linked immunosorbent spot (ELISpot) assay, interferon-gamma (IFN-γ) T cell ELISpot assay, and activation-induced marker (AIM) assay. The study found that vaccine antigen-specific B cell and T cell responses, even among individuals with low antibody responses, indicated no significant differences from those with high antibody responses. Additionally, a positive correlation was identified between the pre-vaccination expression of T follicular helper (Tfh) cells and post-vaccination HI titers/memory B cells in individuals with high antibody responses. This underscores the pivotal role of Tfh cells in immune responses to influenza vaccines. It is a challenging issue to overcome immune imprinting to enhance vaccine efficacy. The study also conducted HI assays for H3N2 strains from the 2014–2015 and 2015–2016 seasons with the current samples, revealing high pre-existing antibody levels against previous strains and a responsive post-vaccination immune response. Pre-existing antibodies can potentially hinder the immune responses to new antigens. Thus, strategies for enhancing vaccine immunogenicity must consider a wide array of immunological factors and their underlying molecular mechanisms. 인플루엔자 백신은 인플루엔자 감염과 그 합병증의 발생을 예방하는 데 중요한 역할을 한다. 그러나, 매년 항원성이 다른 새로운 인플루엔자 바이러스가 유행할 수 있기 때문에, 예상되는 유행 바이러스를 반영하는 새로운 백신으로 매년 접종하는 것이 권장된다. 백신의 효과는 접종자의 면역 상태, 접종 이력, 백신의 종류와 제조 과정, 그리고 그 해 유행하는 바이러스 주와 백신주의 일치 정도에 따라 달라질 수 있다. 인플루엔자 백신의 면역원성을 향상시키기 위해 고용량 백신, 면역증강제가 첨가된 백신, 재조합 백신 등이 개발되었다. 이 연구는 인플루엔자 백신 접종자에서 항체 반응을 평가하고 항체 반응의 정도에 따라 B세포와 T세포 면역반응에도 차이가 있는지 알아보고자 수행되었다. 2021-2022절기에 건강한 참가자 60명에게 백신을 접종하고, 접종 전후에 혈액 샘플을 수집하여 헤마글루티닌 저해 (HI) 항체 역가 분석, B 세포 ELISpot 분석, 인터페론 감마(IFN- γ) T 세포 ELISpot 분석 및 활성화 유도 마커 (AIM) 분석을 사용하여 면역 반응을 분석하였다. 연구 결과, 낮은 HI 항체 역가 반응을 보인 개인들 사이에서도 항원 특이적인 B 세포와 T 세포 반응이 관찰되었으며, 이는 높은 HI 항체 역가 반응을 보인 그룹과 유의미한 차이가 없음을 나타냈다. 또한, 백신 접종 전 여포 보조 T 세포(Tfh)의 발현과 접종 후 HI 항체 역가 및 기억 B 세포 발현 수준 사이에 양의 상관관계가 확인되었다. 이는 인플루엔자 백신에 대한 면역반응에서 Tfh 세포의 중추적인 역할을 강조한다. 면역 기억(immune imprinting)을 극복하고 백신 효과를 개선시키는 것은 어려운 숙제이다. 이 연구에서는 2014-2015년 및 2015-2016년 절기의 H3N2 백신주에 대한 HI 항체 역가 분석을 수행하여, 현재 샘플에서 과거 백신주에 대한 높은 역가의 HI 항체 반응과 접종 후 면역 반응을 확인하였다. 기존의 항체는 새로운 항원에 대한 면역 반응을 방해할 수 있다. 따라서 백신의 면역원성을 개선하기 위한 전략에는 다양한 면역학적 요소와 분자유전학적 매커니즘을 고려해야 한다.

Studies on the Role of Type I Interferon in Regulating Migration of Ag-specific T cells in Tuberculosis and Virus Coinfection

Tae Gun Kang 연세대학교, 일반대학원 2021 국내박사

Chemokines are key factors that influence the migration and maintenance of relevant immune cells into an infected tissue or a tumor microenvironment. Therefore, it is believed that the controlled administration of chemokines in the tumor microenvironment may be an effective immunotherapy against cancer. Previous studies have shown that CCL3, also known as MIP-1 alpha, facilitates the recruitment of dendritic cells for the presentation of tumor antigens and promotes T cell activation. Here, we investigated the role of CCL3 in regulating the tumor microenvironment using a syngeneic mouse tumor model. We observed that MC38 tumors overexpressing CCL3 (CCL3-OE) showed rapid regression compared with the wild type MC38 tumors. Additionally, these CCL3-OE tumors showed an increase in the proliferative and functional tumor-infiltrating T cells. Furthermore, PD-1 immune checkpoint blockade accelerated tumor regression in the CCL3-OE tumor microenvironment. Next, we generated a modified CCL3 protein for preclinical use by fusing recombinant CCL3 (rCCL3) with a non-cytolytic hybrid Fc (HyFc). Administering a controlled dose of rCCL3-HyFc via subcutaneous injections near tumors was effective in tumor regression and improved survival along with activated myeloid cells and augmented T cell responses. Furthermore, combination therapy of rCCL3-HyFc with PD-1 blockade exhibited prominent effect to tumor regression. Collectively, our findings demonstrate that appropriate concentrations of CCL3 in the tumor microenvironment would be an effective adjuvant to promote antitumor immune responses, and suggest that administering a long-lasting form of CCL3 in combination with PD-1 blockers can have clinical applications in cancer immunotherapy. Tuberculosis (TB), caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb), is often exacerbated upon coinfection, but the underlying immunological mechanisms remain unclear. Here, to elucidate these mechanisms, we used a TB and lymphocytic choriomeningitis virus coinfection model. Viral coinfection significantly suppressed Mtb-specific IFN-γ production, with elevated bacterial loads and hyperinflammation in the lungs. Type I IFN signaling blockade rescued the Mtb-specific IFN-γ response and ameliorated lung immunopathology. Single-cell sequencing, tissue immunofluorescence staining, and adoptive transfer experiments revealed that type I IFN produced in response to viral infection inhibited CXCL9/10 production in myeloid cells, resulting in impaired pulmonary migration of Mtb-specific CD4+ T cells from lymph nodes. Thus, virus coinfection-induced type I IFN signaling prior to the pulmonary localization of Mtb-specific Th1 cells exacerbates TB immunopathogenesis by impeding the Mtb-specific Th1 cell influx. Our study highlights another novel negative role of viral coinfection and/or type I IFNs in delaying Mtb-specific Th1 responses in the lung.

Ontogeny, Function and Regulation of Follicular T Cells

Sungnak, Waradon Harvard University ProQuest Dissertations & Theses 2019 해외박사(DDOD)

Virus-like particles as efficient antigen delivery system to induce antigen-specific IgG and IgE immune responses

김주형 서울대학교 대학원 2019 국내석사

Virus-like particles (VLPs) are efficient ways to express antigens of interest for strong induction of antigen specific antibodies. While antibodies against infectious pathogens are key components of prophylactic vaccines, ones that are produced by allergens play crucial roles in allergic reactions. In this thesis study, I examined whether VLPs could be utilized (i) to induce antibody, especially IgG isotype, responses to antigens of MERS-CoV for the identification of potential neutralization targets of MERS-CoV, and (ii) to elicit IgE responses to hen egg lysozyme (HEL), a model allergen, for the investigation of allergenicity of proteins, in mice. In the first part, VLPs that express four different domains of MERS-CoV were produced and administrated in mice for generation of IgG against respective target domains of the spike protein. Using in vitro neutralization assay, I found that IgG antibodies produced by immunization with the VLPs exhibited highly potent neutralizing activity against pseudo-MERS-CoV infection. Proteolytic cleavage site fusion peptide (PSFP), which is responsible for proteolytic cleavage and fusion into target cells, has not been reported as a target of MERS-CoV vaccines. I observed IgG antibody targeting S1, S2, receptor binding domain (RBD), or PSFP exhibited neutralizing ability, particularly in immune serum targeting S1 and RBD, which has been targeted for protective MERS-CoV vaccine development. In the second part, to examine whether VLP system could be used as a sensitization tool in mice, VLP expressing HEL were produced and administrated in mice for elicitation of IgE against HEL protein. Following systemic and local challenges of the VLP-sensitized mice with recombinant HEL protein, increase of serum histamine, reduced mobility and production of cytokines were observed. Taken together, I demonstrate that (i) IgG antibodies produced by VLP immunization are able to neutralize viral infection and (ii) VLP that express model allergens can be an efficient tool to induce allergen specific IgE responses in mice, which could provide a novel platform to investigate allergenicity of proteins. 바이러스유사입자는 특정 항원을 발현시킬 수 있는 효율적인 방법이며, 항원 특이적인 항체를 강하게 유도할 수 있다. 감염성 병원체에 대한 항체는 백신의 중요한 구성물질이지만, 동시에 알레르기 유발 항원에 의하여 생성되어 알레르기 반응을 일으키는데에 핵심 역할을 수행할 수도 있다. 이 논문에서는 바이러스유사입자가 해당 역할을 수행할 수 있는지 논의해보았다. (1) 잠재적인 백신의 중화반응 대상을 규명하기 위한 메르스코로나바이러스의 항원에 대한 IgG 항체를 유도할 수 있는가. (2) 쥐에서 단백질에 대한 알레르기성을 분석하기 위해 모델 알레르기 유발 항원인 암탉 난자 리소자임에 대한 IgE가 생성될 수 있는가. 첫째로, 메르스코로나바이러스의 네 가지 다른 부분을 발현하는 바이러스유사입자를 생성하고, 쥐에 주입하여 바이러스의 스파이크 단백질 특이적인 IgG를 유도하였다. 생체 외 중화반응실험을 통하여, 바이러스유사입자로 접종하여 생성된 IgG 항체가 메르스 모조바이러스의 감염에 대해 굉장히 강한 중화 활성을 보이는 것을 관찰하였다. 단백질 가수분해 효소에 의한 분해와 타겟 세포로의 융합을 매개하는 단백질 가수분해 절단 부위는 백신 개발의 타겟으로 연구된 보고가 없다. 이미 백신 개발에서 타겟으로 많은 연구가 이루어진 수용체 부착 부위에 대한 항체와 비교하여 단백질 가수분해 절단 부위를 타겟으로 하는 IgG 항체가 낮은 농도에서도 더 높은 중화능을 가지는 것을 관찰하였다. 둘째로, 바이러스유사입자 시스템이 쥐에서 감작반응을 유도할 수 있는지 확인하기 위하여 암탉 난자 리소자임을 발현하는 바이러스유사입자를 제작하였고, 암탉 난자 리소자임 특이적인 IgE 항체를 유도하도록 쥐에 주입하였다. 재조합 단백질로 전신적, 국소적 처리 후, 혈청 히스타민이 증가하고, 움직임이 적어지고, 사이토카인이 생성되는 것을 관찰하였다. 결론적으로, 이 연구에서 (1) 바이러스유사입자의 접종으로 생성된 IgG 항체는 바이러스성 감염을 중화시키는 능력이 있고, (2) 모델 알레르기 유발 항원을 발현하는 바이러스유사입자가 항원 특이적 IgE 항체를 생성함으로써 쥐에서 단백질의 알레르기성을 연구하기 위한 과정 중 감작에 사용되기에 효율적인 시스템이라는 것을 알 수 있었다.

A Novel mRNA Platform Produces Robust, Monospecific, Polyfunctional Th1 Responses

Krauss, Kathleen University of Pennsylvania ProQuest Dissertations 2025 해외박사(DDOD)

Helper T cells (TCD4) are lynchpins of adaptive immune responses. Since each TCD4 expresses a single T cell receptor, recognizing specific epitope within major histocompatibility complex class II (MHCII), is often desirable to study a population that responds to the same epitope. We devised a novel method of selective immunization to produce a robust, monospecific TCD4 in mice using a modular mRNA vector. The vector encodes the target epitope attached via flexible linker to MHCII. Immunization with this mRNA selectively elicits TCD4 responses across a range of epitopes and MHCII alleles. These TCD4 show robust, polyfunctional Th1 cytokine release when evaluated in vitro. Additionally, we tested the activity of these TCD4 cells during Salmonella enterica infection, a model of Th1-dependent immune response, and demonstrated their efficacy in vivo in curtailing Salmonella infection.

Defective secondary B cell immune responses in the T-T mice in which CD4+ T cells are educated by MHC class II expressed only on thymocytes

이재기 성균관대학교 일반대학원 2014 국내박사

Although most of CD4+ T cells develop through their interaction with MHC class II molecules on thymic epithelial cells, the MHC class II-dependent T cell-T cell (T-T) interaction can also generate mature CD4+ T cells in the periphery if thymocytes express MHC class II molecules, which is physiologic in human. In the CIITApIV-/-plck-CIITAtg mice (T-T mice; mice deficient in promoter IV of MHC class II transactivator CIITA and transgenic for CIITA under the control of the proximal p56lck promoter), in which thymocytes are educated by MHC class II molecules only on other thymocytes, CD4+ T cells apparently provided efficient B cell help for T cell-dependent antibody responses. Here I investigated the B cell immune responses in the T-T mice compared to wild type (WT) mice in more details and found that the B cell help by CD4+ T cells from the T-T mice (T-T CD4+ T cells) was incomplete in some aspects. T-T CD4+ T cells were inefficient for the effective germinal center reaction and rather preferentially induced extrafollicular B cell responses upon the immunization with NP-KLH (4-hydroxy-3-nitrophenyl acetyl- Keyhole Limpet Hemocyanin). Interestingly, the number of follicular helper T (Tfh) cells in the homeostatic condition without any immunization was increased in the T-T mice and, accordingly, the number of CD4+ T cells in the B cell follicle was also increased in the T-T mice. However, the numbers of Tfh cells and follicularly localized CD4+ T cells in the T-T mice did not increase upon the immunization whereas those in the WT mice increased clearly. The secondary antibody responses in the T-T mice were grossly normal except a poor generation of high affinity IgM antibodies, but bone marrow long-lived plasma cells were scarcely detectable 200 days after immunization of NP-KLH in the T-T mice in contrast to WT mice. The constitutive T-T interaction in the T-T mice appeared to lower the interaction between CD4+ T cells and B cells as the number of B-CD4+ T cell conjugates and doublets with Tfh cells was decreased in the T-T mice. In summary, the T-T CD4+ T cells were partially defective in the B cell help, especially in the germinal center reaction and the generation of bone marrow long-lived plasma cells. The T-T interaction is thought to enrich the T cell immunity by generating diverse kinds of effector T cells including Tfh cells, but T-T CD4+ T cells appear not to provide the complete sets of T cell functions in the absence of conventional T cell-thymic epithelial cell (T-E) CD4+ T cells. 대부분의CD4+ T 세포는 흉선 상피세포의 MHC 클래스 II 분자와 흉선 세포와의 상호작용을 통해서 분화된다. 사람에서는 흉선 세포가 MHC 클래스 II 분자를 표현하며 흉선 세포와 흉선 세포의 결합 (T-T) 을 통한 CD4+ T 세포의 분화가 가능하다고 알려져 있다. 생쥐에서도CIITApIV-/-plck-CIITAtg 생쥐 (T-T 생쥐; MHC 클래스 II transactivator CIITA가 결핍되어 있으면서 근위 p56lck 프로모터의 제어 하에 CIITA 유전자를 발현한 생쥐) 에서 T-T 결합에 의한 CD4+ T세포의 분화가 유도되었고 이 T-T CD4+ T 세포는 T 세포 의존적인 항체반응에서 B 세포에 효율적으로 도움을 주었다고 보고되었다. 그러나 T-T 생쥐에서 항체 면역반응은 조금 떨어지는 경향이 보여 이 논문에서 나는 야생형 (WT) 생쥐와 T-T 생쥐에서의 B 세포 면역 반응을 좀 더 자세하게 비교하였다. 그 결과 T-T CD4+ T세포는B 세포를 돕는데에 있어 몇 가지 측면에서 불완전함을 확인하였다. NP-KLH로 면역하여 B 세포의 면역반응을 유도하면 T-T CD4+ T 세포는 배중심 반응을 효율적으로 유도하지 못했고, 반면 extrafollicular B 세포 반응을 효과적으로 유도하였다. 흥미롭게도 면역하지 않은 자연 상태에서 여포성 도움 T 세포의 수가 T-T 생쥐에서 이미 증가되어 있었고, 이에 따라 B 세포 소낭 내의 CD4+ T 세포의 수도 증가하였다. 면역 유도 시 야생형 생쥐에서는 여포성 도움 T 세포의 수와 B 세포 소낭 내의 CD4+ T 세포의 수가 명확히 증가되었지만, T-T 생쥐에서는 큰 변화가 보이지 않았다. T-T 생쥐에서의 2차 항체 면역반응은 높은 결합력을 가진 항원 특이적 IgM 항체의 생산이 잘 일어나지 않는 부분을 제외하고는 대체로 정상생쥐의 반응과 유사하였다. 그러나 골수 내의 장수 형질 세포의 수를 면역한 후 200일이 지난 뒤에 T-T 생쥐와 야생형 생쥐에서 비교해 보았을 때, T-T 생쥐에서 그 수가 크게 줄어들어 있음을 확인할 수 있었다. 또한 T-T 생쥐에서 CD4+ T 세포와 B 세포의 결합과 여포성 도움 T 세포와 B 세포의 결합이 줄어들어 있는 것을 확인할 수 있었고, 이는 지속적인 T 세포와 T 세포의 결합에 기인한 것으로 보인다. 요약하면, T-T CD4+ T 세포는 B 세포를 돕는데 있어 부분적인 결함이 있고 특히 배중심 반응과 골수내의 장수 형질 세포생성에 결함이 있다. T-T 결합에 의한 CD4+ T 세포의 분화와 기능적 측면에 있어, 이들은 여포성 도움 T 세포를 포함한 여러 가지 효과 T 세포의 증가를 보이지만 정상적인T 세포와 흉선 상피세포의 결합에 의해 만들어진 CD4+ T세포의 기능을 완전히 재현하지 못함을 알 수 있다.

A Study On The Cell-Mediated Immune Responses With Regard To Helper And Cytotoxic T Cells In Olive Flounder (Paralichthys Olivaceus)

정재욱 경상대학교 대학원 2021 국내박사

척추 동물에서 적응 면역 반응에 중요한 역할을 하는 T세포는 그 기능에 따라 도움T세포와 세포독성T세포로 분류된다. 도움T세포와 세포독성T세포는 각각 CD4 및 CD8 당단백질의 발현에 의해 규정된다. 포유류에서 CD4 세포는 4개의 면역글로불린과 유사한 세포 외 도메인 (D1 – D4), 막 관통 영역 및 세포질 꼬리로 구성된다. 포유류의 CD8 세포는 알파 사슬로 구성된 동종이량체 또는 알파 사슬과 베타 사슬로 구성된 이종이량체로 나타나는 막 결합 당단백질이다. CD8알파 및 CD8베타 세포는 모두 면역글로불린과 유사한 세포 외 도메인, 막 관통 영역 및 세포질 꼬리로 구성된다. CD4 당단백질은 N 말단 도메인 (D1과 D2)을 통해 제 2 주요 조직적합성 복합체와 상호작용하고 CD8 당단백질은 면역글로불린 유사 도메인을 통해 제 1 주요 조직적합성 복합체와 상호작용함으로써 외부 항원 인식에 관여한다. T세포의 활성화를 위해, CD4 및 CD8 당단백질의 세포질 꼬리는 Lck 키나아제를 이용하여 항원 인지 신호를 세포 내로 전달한다. CD4-1 및 CD4-2와 같은 두 가지 하위 집단으로 구성된 CD4 세포는 여러 어류 종에서 조사되었다. 4개의 면역글로불린 유사 도메인, 막 관통 영역 및 세포질 꼬리를 포함하는 CD4-1 세포는 포유류의 CD4 세포와 유사하게 나타난다. 반면에 CD4-2로 불리는 두번째 CD4 세포는 2개 또는 3개의 면역글로불린 유사 도메인을 가지고 있다. 물고기의 CD4-1 및 CD4-2 분자는 세포질 영역에 p56lck 티로신 키나아제에 결합할 수 있는 중요한 모티프를 가지고 있으며, 이러한 CD4 분자는 포유류와 유사한 방식으로 Lck와 상호 작용하는 것으로 보인다. 또한 물고기의 CD4 분자는 항원과의 상호 작용 후 세포 내 신호 전달에 필수적인 세포질 모티프를 통한 도움T세포의 활성화에 관여할 수 있다. CD8 세포는 포유류뿐만 아니라 다양한 종의 어류에서 잘 밝혀져 있다. 어류의 CD8 분자는 CD8알파와 CD8베타라는 두 개의 별개의 유전자로 나뉘며 대부분 T세포 표면에서 알파사슬과 베타사슬로 구성된 이종이량체로 표현되고, 이는 포유류 CD8 분자와 유사하다. CD8 유전자의 전체적인 구조는 척추 동물 진화 전반에 걸쳐 잘 유지되어 왔으며, 주요 영역은 포유류와 어류에서 유사하게 구분된다. 그러나 p56lck 결합 부위로 알려진 C-X-C 모티프는 포유류의 CD8알파 세포질 꼬리에서만 찾을 수 있는 반면, C-X-C 모티프 대신 C-X-H 모티프는 어류에서 CD8알파 및 CD8베타 서열 모두에 존재한다. 어류에서의 CD4 및 CD8 유전자의 발현이 포유류에서와 유사하게 나타나지만, CD4 및 CD8 세포를 탐지하기 위한 단일클론항체가 부족해 어류에서의 CD4 및 CD8 세포의 기능을 밝히는 데는 한계가 있다. CD4 와 CD8 림프구를 특이적으로 탐지할 수 있는 단일클론항체가 넙치를 포함한 여러 종의 어류에 존재하지만 CD4 및 CD8 림프구와 관련된 세부적인 기능적 활동에 대한 연구는 여전히 부족하다. 본 연구에서는 넙치의 CD4 T세포에 속하는 CD4-1, CD4-2 림프구와 CD8 T세포에 속하는 CD8 림프구를 특이적으로 탐지하는 단클론항체를 개발하였다. 네 종류의 단클론항체는 효소 면역 분석법, 웨스턴 블롯 분석, 면역형광염색, 유세포 분석 및 역전사효소중합효소연쇄반응을 통해 항원으로 작용한 각각의 단백질에 특이적으로 반응하는 것으로 밝혀졌다. 이 항체들을 이용하여 바이러스, T세포 자극 항원, B세포 자극 항원을 생체 내 감염 후 실제 넙치의 세포 매개 면역 반응에 중요한 역할을 하는 CD4 및 CD8 T 림프구의 증감을 조사하였다. 또한 여러 종류의 사이토카인 및 전사 인자의 발현을 관찰함으로써 세포 매개 면역 반응에서 도움T세포와 세포독성T세포의 역할을 검증하였다. Chapter 1 : 포유류에서 4개의 면역글로불린 유사 세포 외 도메인을 가진 한 종류의 CD4 T세포가 존재하는 것과 달리 어류에서는 포유류의 CD4 T세포와 유사한 CD4-1 T세포와 2개 혹은 3개의 면역글로불린 유사 세포 외 도메인을 가진 CD4-2 T세포가 존재한다. 본 연구에서는 넙치의 CD4-1과 CD4-2 유전자를 중합효소 반응을 통하여 증폭시키고 박테리아 및 진핵 생물 발현 시스템을 통해 재조합 단백질을 생산하였다. 재조합 단백질을 항원으로 하여 CD4-1과 CD4-2 단백질을 탐지하는 작용하는 단클론항체를 생산하였다. 면역 형광 염색을 통하여 본 연구에서 개발된 두 종류의 단클론항체는 각각 CD4-1 림프구와 CD4-2 림프구를 특이적으로 탐지하며 특히 단클론항체의 결합 부위가 림프구의 세포 표면에 존재한다는 것을 확인하였다. 또한 단클론항체 양성 림프구의 유전자 전사체가 역전사효소중합효소연쇄반응을 통해 B세포 전사체가 아닌 T세포 전사체를 발현하는 프라이머에 의해서만 증폭되는 것으로 미루어 보아 단클론항체의 특이성이 T세포에 특이적이다는 것을 알 수 있었다. 두 종류의 CD4 T세포의 림프성 기관과 비림프성 기관에서의 분포도를 유세포 분석을 통하여 조사해본 결과 상대적으로 높은 수치의 CD4-1 T세포와 CD4-2 T세포 비율이 림프성 기관인 신장과 비장에서 나타났다. 본 연구에서 규명된 CD4 T세포 특이적 단클론항체를 통해 넙치의 CD4 T세포가 세포 형태학적 측면, 조직별 분포도 및 유전자 발현 면에서 포유류의 CD4 T세포와 유사하다는 것을 검증하였다. Chapter 2 : CD8 림프구를 특이적으로 탐지할 수 있는 단일클론항체가 넙치를 포함한 여러 종의 어류에 존재하지만 CD8 림프구와 관련된 세부적인 기능적 활동에 대한 연구는 여전히 부족하다. 본 연구에서는 CD8 T세포에 속하는 CD8알파와 CD8베타 세포의 유전자 서열 중 2차 구조, 항원성, 친수성 및 소수성을 고려하여 펩타이드를 합성하였다. 합성된 펩타이드를 이용하여 CD8알파 및 CD8베타 세포를 탐지하는 단클론항체를 마우스 면역을 통해 생산하였다. 생산된 단클론항체가 각각의 CD8 유전자 전체를 클로닝한 재조합 단백질에도 특이적으로 반응할 수 있음을 효소 면역 분석법, 웨스턴 블롯 분석 및 형광 염색을 통하여 증명하였다. 본 연구에서 개발된 두 종류의 단클론항체는 면역 형광 염색을 통하여 각각 CD8알파 림프구와 CD8베타 림프구, 특히 림프구의 세포 표면을 탐지한다는 것을 알 수 있었다. 또한 CD8알파 및 CD8베타 단클론항체의 반응성이 T세포에 특이적이다는 것을 역전사효소중합효소연쇄반응을 통해 확인되었다. 두 종류의 CD8 특이적 단클론항체를 이용한 유세포 분석을 통하여 CD8 T세포의 조직별 분포도를 조사해본 결과 상대적으로 높은 수치의 CD8 T세포 비율이 신장과 비장뿐만 아니라 아가미와 장에서도 나타났다. 본 연구에서 검증된 CD8알파 및 CD8베타 T세포를 특이적으로 탐지하는 단클론항체를 통해 넙치의 CD8 T세포가 세포 형태학적 측면, 조직별 분포도 및 유전자 발현 면에서 포유류의 CD8 T세포와 유사하다는 것을 확인하였다. Chapter 3 : 넙치는 우리나라에서 경제적으로 중요한 양식 종으로 어류의 면역 체계 연구를 위한 모형 어종으로 사용된다. 본 연구에서는 넙치의 주요한 바이러스성 질병 중의 하나인 신경괴사증바이러스 (Nervous necrosis virus, NNV)와 T세포 자극 항원인 Keyhole limpet hemocyanin (KLH) 및 Lipopolysaccharide (LPS)를 감염시키고 시간이 지남에 따라 CD4 T세포와 CD8 T세포의 증감을 유세포 분석을 통해 확인해 보았다. NNV 및 KLH 감염 후 CD4 및 CD8 양성 세포는 PBS를 접종한 대조군에 비해 상당히 증가한 반면, LPS 감염 그룹에서는 일정한 수준을 유지하였다. 비장, 신장 및 말초 혈액에서 CD8 양성 세포의 증가는 CD4 양성 세포의 증가보다 더 일찍 나타났다. 또한 감염 1일과 3일 후 사이토카인과 전사 인자의 발현을 실시간 중합효소연쇄반응을 통해 관찰한 결과 NNV 및 KLH 처리 후 Th1 관련 유전자는 Th2 관련 유전자보다 더 빠르고 많이 증가하였다. 이러한 결과는 CD4-1 림프구보다 CD4-2 림프구가 CD8 림프구와 협력하여 Th1 면역 반응에서 더 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다. 본 연구에서 개발된 단클론항체는 어류의 도움T세포 및 세포독성T세포의 기능에 대해 이해하고 지식을 확장하는데 유용한 도구로서 활용되어 후속연구에 이바지할 수 있을 것으로 판단된다.

(The) DNA methylation and single-cell transcriptome analysis to understand resistance mechanisms of anti-PD-1 immunotherapy in non-small cell lung cancer patients

조재원 Graduate School, Yonsei University 2021 국내박사

Cancer is a well-known threatening disease that poses a global threat. Accordingly, surgery, chemotherapy, radiotherapy, and targeted therapy have been developed. Recently, the immune checkpoint inhibitor, which reboots the immune system in the tumor microenvironment has shown remarkable clinical benefits. However, the underlying association between the methylomic alteration of cancer and the efficacy of the immune checkpoint inhibitor is unclear. In addition, the underlying mechanism of EGFR mutation and the efficacy of the immune checkpoint inhibitor in lung cancer are also unclear. Here, I compared the methylation status between responders and non-responders pre-treated with anti-PD-1 therapy using the Infinium Methylation EPIC Array. We found that alteration of methylation in the enhancer regions contributed to the epigenetic regulation of the anti-PD-1 response more than the promoter regions. In addition, CYTIP and TNFSF8 were more predictive than the former marker PD-L1 for anti-PD-1 response and progression-free survival (PFS) and overall survival (OS) in a validation cohort, suggesting their potential as predictive biomarkers for anti-PD-1 immunotherapy. Next, I compared EGFR mutant (EGFR-MT) and wild-type (EGFR-WT) tumors via single-cell transcriptomic analysis to analyze the unfavorable factor of EGFR-MT associated with anti-PD-1 therapy. I found that B cells, CXCL13-producing follicular helper CD4+ T (TFH)-like cells, and tissue-resident memory CD8+ T (TRM)-like cells decreased in EGFR-MT tumors. I found that the NOTCH-RBPJ regulatory network for the TRM state is appeared in EGFR-MT tumors. Notably, the proportion of TRM-like cells is highly predictive of an anti-PD-1 response in NSCLC. Our findings suggest that impairment of TFH-B-TRM lymphocyte cooperation, potentially in the formation of the tertiary lymphoid structure, accompanied by dysregulation of TRM homeostasis and TFH-B crosstalk, underlies the unfavorable anti-PD-1 response in EGFR-MT lung tumors. 암은 전 세계적으로 잘 알려진 위협 질병이다. 따라서 수술, 화학 요법, 방사선 요법 및 표적 요법이 개발되었다. 최근 종양 미세 환경에서 면역 체계를 재활성화 시키는 면역 항암치료는 매우 뛰어난 항암효과를 나타냈다. 그러나, 암의 메틸화 변화와 면역 항암치료의 효능 사이의 근본적인 메커니즘은 명확하지 않다. 또한 폐암에서 EGFR 돌연변이의 근본적인 메커니즘과 면역 항암치료의 효능에 대해 불분명하다. 여기에서는 Infinium Methylation EPIC Array를 사용하여 항 PD-1 치료를 받기 전의 반응군 및 비반응군 간의 메틸화 상태를 비교했다. 우리는 인핸서 영역에서 메틸화의 변경이 프로모터 영역보다 항 PD-1 반응의 후성적 조절에 더 많이 기여한다는 것을 발견했다. 또한 CYTIP 및 TNFSF8은 유효성 검사 코호트에서 항 PD-1 반응 및 무-진행 생존 (PFS) 및 전체 생존 (OS)에 대해 이전 마커 인 PD-L1보다 더 예측 가능했으며, 이는 항 PD-1 면역 항암 치료에 새로운 마커를 제시하는 결과이다. 다음으로 단세포 전사체 분석을 통해 EGFR 돌연변이 (EGFR-MT)와 비돌연변이 (EGFR-WT) 종양을 비교하여 항-PD-1 요법과 관련된 EGFR-MT의 유해인자를 분석했다. EGFR-MT 종양에서 B 세포, CXCL13 생성 여포 CD4+ T (TFH) 세포 및 조직-거주 기억 CD8+ T (TRM) 유사 세포가 감소하는 것을 발견했다. 우리는 EGFR-MT 종양에서 사라진 TRM 상태에 연관된 NOTCH-RBPJ 조절 네트워크를 발견했다. 특히, TRM 유사 세포의 비율은 NSCLC에서 항 -PD-1 반응에 대해 좋은 예측력을 보였다. 우리의 연구 결과는 TRM 항상성 및 TFH-B 형성의 조절 장애와 함께 잠재적으로 3차 림프 구조의 형성에서 TFH-B-TRM 림프구 협력의 손상이 EGFR-MT 폐 종양에서 항-PD-1 면역 요법에서 예후가 좋지 않게 작용하는 메커니즘을 발견했다.