The antitumor effects of Veillonella parvula in syngeneic tumor models

윤성현 서울대학교 대학원 2023 국내박사

정상면역계는 비정상적으로 생성된 세포인 암세포를 감시, 공격, 제거할 수 있다. 그러나 암은 면역 세포의 cytotoxic T lymphocyte–associated antigen 4 (CTLA-4) 또는 programmed cell death protein 1 (PD-1)과 같은 면역 관문 (immune checkpoint) 을 통해 면역 세포를 비활성화함으로써 면역 세포의 공격을 회피한다. 따라서 면역관문억제제 (immune checkpoint inhibitor; ICI) 는 숙주 면역세포의 비활성화를 차단하여 치료 잠재력을 유도하는 효과적인 치료법이 될 수 있다. 그럼에도 불구하고 많은 고형암은 면역관문억제제에 내성을 보이며 반응률이 여전히 낮을뿐 아니라 면역관문억제제의 효과가 검증된 암에서도 환자마다 반응성이 다르다. 따라서 이러한 면역관문억제제의 낮은 반응성을 해결할 필요가 있다. 최근 연구들은 장내 미생물이 항종양 면역에 영향을 미칠 수 있고, 환자들의 장내 미생물의 조성에 따라 면역관문억제제 치료법의 효능과 연관성이 있다는 강력한 증거를 제공한다. 최근 항종양 효능이 있는 공생 미생물을 발굴하고자 하는 연구에 대한 관심이 높아지고 있다. 이러한 연구들는 장내 미생물군집의 조성이 면역관문억제제 치료받은 환자들 중 고반응군과 저반응군 환자 사이에서 다르다는 것을 보여주었다. 그러나 이런 연구들은 대부분 항종양 약물의 효능과 연관성이 있는 장내 미생물을 결정하는 것으로 제한되어 있으며, 소수의 연구만이 이러한 장내 미생물과 관련된 항종양 기전을 밝혀냈다. 따라서, 항암제의 효능과 장내 미생물군의 인과관계뿐만 아니라 효과적인 미생물군의 항암기전을 규명할 필요가 있다. 또한, 질병을 완화시키는 미생물군에 대한 현재 연구는 특정 유효 미생물을 발견하고 적용하는 데 국한되어 있다. 그러나 환경 변화에 대한 미생물의 취약성을 고려할 때, 박테리아 효능의 안정성 또는 재현성을 위해서는 박테리아 내 유효성 물질을 발견하는 것이 필요할 수 있다. 따라서 본 논문은 면역관문억제제의 반응성과 관련이 있는 것으로 알려진 박테리아 중에서 가장 항종양 효능이 있는 후보균을 선정하고, 후보균의 항종양 기전을 밝히고, 박테리아 내에서 항종양 효능을 갖는 핵심 물질을 찾고자 했다. 첫째, 참고 문헌에서 항암 효능과 관련이 있다고 보고된 16개의 이용 가능한 박테리아를 선정했다. 이런 선정된 박테리아들이 실제로 항종양 효과가 있는지 확인하기 위해 MC38 종양 유도 마우스에 16개 박테리아의 혼합물을 종양 내에 투여하고 종양 성장 억제 효과를 관찰했다. 동시에 16개 박테리아 혼합물의 저온살균 (pasteurization)을 통해 균주들의 대사산물이 이러한 항암효과와 관련이 없음을 확인했다. 16개 박테리아들 중 주요 효능 박테리아를 결정하기 위해 인비트로로 종양 보유 마우스의 비장세포에 각 박테리아를 처리하고 16개 박테리아들의 항종양 관련 사이토카인 분비 능력을 비교했다. 그 결과 베일로넬라 파르불라와 아커만시아 뮤시니필라가 IFNγ와 같은 항암 사이토카인의 가장 두드러진 분비능을 보였다. 이 두 박테리아를 제외하고 나머지 14개 박테리아 혼합물의 항종양 효능은 생체내 피하 종양 모델에서 사라졌다. 그리고 비장세포를 이용한 종양세포사멸 실험을 통해 베일로넬라 파르불라가 두 박테리아 중 후보로 선정되었다. 동물모델에서 이러한 베일로넬라 파르불라의 항종양 효능은 종양 세포의 종류, 마우스 계통 또는 투여 방법에 관계없이 나타났다. 또한, 살아있는 베일로넬라 파르불라 및 저온살균 된 베일로넬라 파르불라는 동일한 종양 성장 억제 효능을 나타냈다. 흥미롭게도 베일로넬라 속의 다른 종인 베일로넬라 아티피카는 항종양 효과가 없었고, 이는 항종양 효과가 베일로넬라 파르불라에 특이적임을 나타낸다. 마지막으로 베일로넬라 파르불라는 면역관문억제제 및 TGF-베타 신호 억제제같은 항암제와 병용효과가 있었다. 따라서 이러한 결과는 베일로넬라 파르불라가 가장 효과적인 후보로서 실질적인 항종양 효과가 있음을 시사한다. 둘째, 베일로넬라 파르불라의 항종양 면역기전을 조사하였다. 베일로넬라 파르불라의 항종양 효능은 CD4 T 세포 및 CD8 T 세포와 같은 T 세포에 의존하지 않았으며, 이는 CD8 중화항체를 이용한 CD8 결핍 모델 또는 누드 마우스 모델을 이용하여 검증하였다. 또한 선천성 림프구인 NK 세포가 베일로넬라 파르불라의 항암 효능에 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다. 다음으로, 골수세포 (myeloid cell) 중 베일로넬라 파르불라에 의해 호중구만이 유의하게 증가하였다. 이러한 증가가 종양뿐만 아니라 비장 및 골수에서도 관찰된 것을 감안할 때 베일로넬라 파르불라에 의한 이러한 호중구 증가는 전신적 반응으로 추정된다. 그러나 이러한 호중구 증가는 항암 효과가 없는 베일로넬라 아티피카의 투여에 의해서는 발생하지 않았다. 호중구 결핍 모델 및 면역세포들중 호중구만 기능하는 NSGA 모델에 베일로넬라 파르불라를 투여한 결과 호중구가 베일로넬라 파르불라의 항종양 효능에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 베일로넬라 파르불라는 호중구의 양을 증가시킬 뿐만 아니라 호중구의 항종양 기능까지 증가시키는 것으로 관찰되었다. 호중구에서 항종양 표현형 관련 마커의 RNA 발현 증가와 유세포 분석을 통해 항종양 표현형을 지닌 호중구 비율의 증가를 확인했다. 생체 외 (ex vivo) 세포독성분석에서 베일로넬라 파르불라는 호중구의 종양 세포독성 기능을 증가시키는 것을 확인했고, 베일로넬라 파르불라는 종양을 직접적으로 죽일 수 있는 ROS와 NO의 분비를 증가시키는 것으로 확인되었다. 이러한 호중구의 활성화는 패턴 인식 수용체(pattern recognition receptor; PRR) 중 TLR2를 통해 유도되었다. 따라서, 위 내용을 종합하면 베일로넬라 파르불라의 항암 효능이 호중구를 기반으로 하며, 이러한 항종양 표현형을 갖는 호중구가 TLR2의 활성화에 의해 유도되었음을 나타낸다. 셋째, 베일로넬라 파르불라내에서 항암 효능을 유도하는 유효 물질을 발굴하고자 했다. 위에 언급한 결과에서 베일로넬라 파르불라의 생균과 저온살균된균 사이에 항암 효과에 차이가 없었기 때문에 베일로넬라 파르불라의 막 분획을 추출하여 종양 보유 마우스에 처리하여 항종양 효과를 조사했다. 그 결과 베일로넬라 파르불라의 막 분획은 종양 성장을 억제했다. 베일로넬라 파르불라의 막 분획 중 어떤 하위 분획이 중요한 역할을 하는지 확인하기 위해 프로나제 (pronase)로 막 분획을 처리하였다. 프로나제 처리는 종양 억제 효과뿐만 아니라 막 분획의 호중구 증가 능력도 소실시켰다. 이는 단백질이 베일로넬라 파르불라 내에서 항종양 기능을 위한 베일로넬라 파르불라 막 분획의 주요 하위 분획일 수 있음을 시사한다. 호중구 증가 및 항암 효과는 베일로넬라 아티피카 균 자체나 막 분획 투여에 의해서는 유도되지 않았다. 따라서 두 베일로넬라 종의 막 분획 사이의 비교 단백질체 분석을 수행하여 항종양 효능이 있는 핵심 단백질을 발굴하고자 했다. 베일로넬라 파르불라의 막 분획에서 가장 풍부한 단백질인 Vpar0556의 항암 효능을 먼저 확인했지만 Vpar0556은 항암 억제 효과가 없었고 호중구의 증가도 유발하지 않았다. 다음으로 베일로넬라 아티피카에는 존재하지 않고 베일로넬라 파르불라에만 존재하는 단백질 중 가장 많은 단백질인 Vpar0143을 후보 단백질로 선정하였다. ferritin Dps 계열 단백질로 규명되는 Vpar0143은 종양의 성장을 억제했고 더불어 종양내 호중구의 비율의 증가시켰다. 베일로넬라 파르불라의 결과와 마찬가지고 Vpar0143의 투여는 호중구의 양적인 측면뿐 아니라 이런 호중구의 항암 기능 또한 증가시켰다. 따라서 베일로넬라 파르불라의 Ferritin Dps 계열 단백질인 Vpar0143은 호중구를 활성화시켜 항암 효과를 나타내는 주요 물질이었다. 결론적으로, 면역관문억제제의 반응과 관련이 있는 것으로 알려진 16개 박테리아의 시험관 내 (in vitro) 및 생체 내 (in vivo) 스크리닝을 통해 베일로넬라 파르불라가 종양 성장을 감소시키는 가장 효과적인 후보군으로 확인되었으며, 베일로넬라 파르불라는 T 세포의 존재 여부에 관계없이 호중구를 활성화시켜 종양 성장을 억제할 수 있음을 추가로 발견했다. 또한 베일로넬라 파르불라와 면역관문억제제와 TGFβ 신호전달억제제 등의 항암제를 함께 투여하면 향상된 항암 효과를 나타내는 것으로 관찰되었다. 마지막으로, 베일로넬라 파르불라의 Ferritin Dps 계열 단백질인 Vpar0143이 호중구 활성화 및 항종양 효과에 중요한 것으로 밝혀졌다. 따라서 본 연구의 발견들은 항종양 임상 치료에서 새로운 미생물 응용의 가능성을 제공한다. Immune checkpoint inhibitors (ICI) belongs to immunotherapies by inducing the therapeutic anticancer potential of the host immune system. Nevertheless, many solid cancers show resistance to ICI therapy, and response rates remain low and differ between patients, even in those cancers where ICI therapy has provided benefit. Recent studies have showed that composition of the intestinal microbiome may be associated with the efficacy of ICI therapy in which the composition of the gut microbiota differs between high-response and low-response patients treated with ICI. However, the majority of these studies have been limited to determining the gut microbiota associated with the efficacy of antitumor medications, and only a few studies have revealed the antitumor mechanisms in relation to the gut microbiota. Therefore, there is need to elucidate not only the causal relationship between the efficacy of anticancer drugs and gut microbiota but also the anticancer mechanism of the effective microbiota. In addition, current research on the microbiome that alleviates diseases is limited to discovering and applying specific effective microorganisms. However, considering the vulnerability of microorganisms to environmental changes, it may be necessary to discover the effective substances within the bacteria for stability or reproducibility of the efficacy of the bacteria. Therefore, this thesis intends to select the candidate with the most antitumor efficacy among the bacteria known to be related to the reactivity of ICI, to elucidate the immunological antitumor mechanism of the candidate bacteria, and to discover key molecule with antitumor efficacy within the bacteria. First, 16 available taxa that have a relationship with anticancer efficacy were selected from references. To check whether these taxa are actually effective for antitumor, a mixture of 16 taxa was intratumorally administered to MC38 tumor bearing mice, and the tumor growth inhibitory effect was observed. At the same time, through the pasteurization of 16 taxa mixture, it was confirmed that the metabolites of the strains were not related to these anticancer effects. Each taxon was treated to splenocytes from tumor bearing mice in vitro, and the antitumor-related cytokines secretion ability was compared among 16 taxa. As a result, Veillonella parvula and Akkermansia muciniphila showed the most prominent secretory ability of anticancer cytokines such as IFNγ. And then, V. parvula was selected as a candidate among the two taxa for its cytotoxicity in co-culture experiments with splenocytes. The antitumor efficacy of V. parvula was shown regardless of types of tumor cells, mice strains, or administration methods. Finally, V. parvula was effective in combination with anticancer drugs including ICI therapy and TGF-beta signaling inhibitor. Thus, these results suggest that V. parvula had an actual antitumor effect as the best effective candidate. Second, the antitumor immune mechanism of V. parvula was investigated. The antitumor efficacy of V. parvula was not dependent on T cells such as CD4 T cells and CD8 T cells. Additionally, it was also verified that NK cells, which are innate lymphoid cells, did not affect the anticancer efficacy of V. parvula. Next, among myeloid cells, only neutrophils were significantly increased by V. parvula. Given that this increase was observed not only in tumor but also in spleen and bone marrow, it is assumed that this increase of neutrophil by V. parvula is a systemic response. Given that RNA expression of antitumor phenotype-related markers in neutrophils was increased and the frequency of neutrophils with antitumor phenotype was increased through flow-cytometry analysis, V. parvula also increased antitumor phenotype of neutrophils. Additionally, ex vivo cytotoxicity assay showed that V. parvula induced the tumor-cytotoxic function of neutrophils through secretion of ROS and NO, which can directly kill tumors. Activation of these neutrophils was induced through TLR2 among pattern recognition receptors (PRR). Therefore, these indicate that the anticancer efficacy of V. parvula was based on neutrophils, and neutrophils with such antitumor phenotype were induced by activation of TLR2. Third, effective substances in V. parvula that induce the anticancer efficacy were explored. The membrane fraction of V. parvula was first extracted and treated to tumor-bearing mice to investigate the antitumor efficacy. As a result, the membrane fraction of V. parvula inhibited tumor growth. And then, the proteins turned out to be the main subfraction of V. parvula membrane fraction through pronase treatment. Interestingly, Veillonella atypica, another species of Veillonella, had no antitumor effect, indicating that the antitumor effect was specific for V. parvula. Therefore, comparative proteomics between membrane fractions of two Veillonella species was conducted to identify the key protein with antitumor efficacy. Vpar0143, the most abundant protein among the proteins that are not present in V. atypica but only in V. parvula, was selected as a candidate protein. Vpar0143, the ferritin Dps family protein, inhibited tumor growth and increased the proportion of neutrophils. In addition to quantitative aspects, these neutrophils have an antitumor phenotype and antitumor function by treatment of Vpar0143. Therefore, Vpar0143, the Ferritin Dps family protein of V. parvula, was main component with anticancer efficacy by activating neutrophils. In conclusion, through in vitro and in vivo screening of 16 taxa known to be associated with responses of ICI, V. parvula was identified to be the most effective taxon in reducing tumor growth and it was further discovered that the bacteria can activate neutrophils. Additionally, it was observed that V. parvula and anti-cancer medications such as immune checkpoint inhibitors and TGFβ signaling inhibitors have a synergistic antitumor effect when treated together. Finally, it was found that Vpar0143, a Ferritin Dps family protein from V. parvula, is crucial for the neutrophil activation and their anti-tumor effects. These findings provide the prospect of a novel microbe application in antitumor clinical treatment.

Investigation of the molecular mechanism in antitumor effect by Akkermansia muciniphila combined use of cancer immunotherapy

전슬기 서울대학교 대학원 2021 국내석사

장내미생물은 암 성장을 억제하고, 면역항암요법에 대한 낮은 치료 반응성을 높이는데 중요한 역할로 많은 관심을 받고 있다. 특히, 최근 연구에 따르면 종양이 있는 마우스에 항생제 처리 후, 아커만시아 뮤시니필라를 구강투여하였을 때, 면역항암제 효과가 회복되는 것이 밝혀졌다. 하지만, 아커만시아 뮤시니필라 균주 유래의 어떤 성분이 항암 효과를 높이고, 어떤 면역 변화를 일으키는지에 대한 연구는 진행되지 않았다. 본 연구에서 건강한 성인의 장에서 분리한 아커만시아 뮤시니필라와 아커만시아 뮤시니필라 유래 펩티도글리칸의 종양 성장 억제 및 항암 면역세포의 증진 효과를 확인하였다. 비장세포에 처리시 암성장을 억제하는 사이토카인인 인터페론감마를 증가시키는 아커만시아 뮤시니필라 균주를 선별하고, 골수 수지상 세포에 처리하여 아커만시아 뮤시니필라 유래 펩티도글리칸이 면역반응 조절에 중요한 유형인식수용체 관련 유전자인 톨 유사 수용체2(Tlr2), 뉴클레오타이드 결합 올리고머화 도메인1(Nod1)의 발현을 증가시키는 유효한 성분이라는 것을 찾아내었다. 또한, 아커만시아 뮤시니필라와 아커만시아 뮤시니필라 유래 펩티도글리칸을 투여하였을 때, 대장암이 이식된 마우스 모델에서 암 성장이 억제되는 것을 확인하였다. 더욱이, 선별된 아커만시아 뮤시니필라 유래 펩티도글리칸과 면역항암제의 병용투여는 면역항암제의 치료 효과를 높였으며, 이것은 인터페론감마를 생산할 수 있는 CD4, CD8 T 세포와 종양괴사인자 알파를 생산할 수 있는 CD4, CD8 T 세포와 같은 항암 면역 기능 향상과 관계가 있는 것을 확인하였다. 이러한 발견은 미생물 유래 물질에 의한 항암 면역 기능 변화에 대한 이해에 도움을 줄 수 있으며, 면역항암제 치료에 미생물 유래 분획과의 병용을 통한 반응성 증대 가능성을 제시할 수 있다. Gut microbes have gained much attention for their key role in inhibiting cancer growth and increasing low therapeutic response to cancer immunotherapy. In particular, it was found that when Akermansia muciniphila was administered by oral gavage after antibiotics treatment, the effect of the cancer immunotherapy was reinstated in the animal experiments. However, no study has been conducted on what components of Akermansia muciniphila enhance the antitumor effect and altered antitumor immunity. Here we confirmed the tumor growth inhibitory effect and antitumor immunity enhancement of Akermansia muciniphila which was isolated from the healthy adults gut and Akermansia muciniphila-derived peptidoglycan. We screened Akermansia muciniphila strain that elevated the antitumor cytokine interferon-γ when treated with splenocytes and found out Akermansia muciniphila-derived peptidoglycan as an effective component that upregulation of the pattern recognition receptor-related genes like Toll-like receptor 2 (Tlr2), nucleotide-binding oligomerization domain 1 (Nod1) expression when treated with bone marrow dendritic cells. Also, administration of Akermansia muciniphila and Akermansia muciniphila-derived peptidoglycan suppressed tumor growth in a colon adenocarcinoma mouse model. Moreover, the efficacy of cancer immunotherapy was increased through co-administration with anti-PD-1 antibody and Akermansia muciniphila-derived peptidoglycan in a colon adenocarcinoma mouse model, and it was related to the enhancement of antitumor immunity like interferon-γ producing CD4, CD8 T cells and tumor necrosis factor-α producing CD4, CD8 T cells in tumor and tumor draining lymph nodes tissues. These findings may help to understand the alteration in antitumor immunity by gut microbe-derived components and suggest the potential use of microbe-derived components in enhancing cancer immunotherapy responses.

Studies on Optimization of Antitumor Effect by Gene-based Immunotherapy : 유전자 기반 면역 치료의 항암 효능 최적화에 관한 연구

서상환 포항공과대학교 2011 국내박사

The immune system is able to identify and control tumors in a process termed cancer immunosurveillance. Advances in molecular and genetic research have broadened the understandings on the interplay between cancer and the immune system and enable development of cancer immunotherapeutics. Although cancer immunotherapy has greater specificity to tumors than conventional cancer therapeutics, further enhancement of its therapeutic efficacy using versatile approaches including manipulation of immunotherapeutics via genetic engineering, selection of optimal regimen, and invention of delivery system to elicit tumor regression in clinics is required. In the first part of this study, human papillonavirus (HPV) DNA vaccines containing E6 and E7 antigens were generated through codon optimization (Co), fusion of E6 and E7, and addition of a tissue plasminogen activator (tpa) signal sequence, CD40 ligand (CD40L), or fms-like tyrosine kinase-3 ligand (Flt3L). The resulting plasmid DNA constructs were investigated in terms of their antitumor activity as well as their induction of HPV-specific CD8+ T cell responses. When E6Co and E7Co were fused (E67Co), CD8+ T cell responses specific for E6 or E7 antigen decreased, but the preventive antitumor effect improved, demonstrating the importance of broad immunity. Interestingly, Flt3L-fused HPV DNA vaccine exhibited stronger E6- and E7-specific CD8+ T cell responses as well as therapeutic antitumor effect than that of CD40L linked HPV DNA vaccine. Finally, the optimal construct, tFE67Co, was generated by including tpa signal sequence, Flt3L, fusion of E6 and E7, and codon optimization, which induces 23 and 25 times stronger E6- and E7-specific CD8+ T cell responses than those of initial E67 fusion construct. In particular, inclusion of electroporation in intramuscular immunization of tFE67Co further enhances HPV-specific CD8+ T cell responses, leading to complete tumor regression in a therapeutic setting. In the second part of this study, strategies to enhance antitumor efficacy of mesenchymal stem cell (MSC) expressing modified interleukin-12 (MSCs/IL-12M) were investigated because MSC has been considered as an ideal delivery vehicle for cancer gene therapies or therapeutic vaccines due to tumor tropism and prolonged transgene expression. Intratumoral (i.t.) injection of MSCs/IL-12M exhibited stronger tumor-specific T cell responses and antitumor effects as well as more sustained expressions of IL-12 and IFN-g in both sera and tumor sites than did IL-12M-expressing adenovirus (rAd/IL-12M) in mice bearing both solid and metastatic tumors. Subcutaneous (s.c.) injection of MSCs/IL-12M at contra-lateral sites of tumor exhibited similar levels of serum IL-12 and IFN-g as i.t. injection but much weaker antitumor effects in both B16F10 melanoma and TC-1 cervical cancer models than i.t. injection. Although intravenous (i.v.) injection elicited earlier peak serum levels of cytokines, it induced weaker tumor-specific T cell responses and antitumor effects than i.t. injection, indicating that serum cytokine levels are not surrogate indicators of antitumor effects. Taken together, these results indicated that MSC is more efficient than adenovirus as a cytokine gene delivery vehicle and that i.t. injection of MSCs/IL-12M is the best approach to induce strong tumor-specific T cell responses that correlate with anti-metastatic effects as well as inhibition of solid tumor growth, although MSCs themselves have an ability to migrate into the tumor site. In addition, MSCs/IL-12M embedded in Matrigel (MSCs/IL-12M/Matrigel) exhibited significant antitumor effects even in immunodeficient mice such as SCID and BNX mice lacking T, B, and NK cells, but not in IFN-g knock-out mice. These findings provide an optimal approach for designing an efficient clinical protocol of MSC-based cytokine gene therapy to induce strong tumor-specific T cell responses and therapeutic anticancer efficacy.

A mechanistic study on antitumor immune control and escape in HER2-expressing tumor models : HER2 발현종양동물모델에서 항종양면역억제 및 회피기전 연구

Sayyed Nilofar Danishmalik 강원대학교 대학원 2016 국내석사

Animal tumor models have been useful for testing antitumor immunity. In the CT26/HER2 and 4T1.2/HER2 tumor models, CT26/HER2 cells formed tumors that continued to grow, whereas 4T1.2/HER2 cells formed tumors that eventually regressed. Here, we investigated how these two cell lines behaved differently. 4T1.2/HER2 tumor-regressed animals displayed antitumor responses to CT26/HER2 cells, suggesting that CT26/HER2 cells are still susceptible to antitumor immunity. When immune cells from 4T1.2/HER2 tumor-bearing animals were stimulated in vitro with HER2 class I peptides, they produced 2-fold increased IFN- levels, mainly in response to the peptides, HER263-71 and HER2342-350. In contrast, antigen non-specific and massive IFN- production levels were observed with immune cells from CT26/HER2 tumor-bearing mice. 4T1.2/HER2 tumor-bearing mice displayed in vivo CTL activity to HER263-71 but not to HER2342-350, whereas no such induction was observed in CT26/HER2 tumor-bearing mice. When the 4T1.2/HER2 cell-challenged mice were depleted of CD8+ T cells, they lost their tumor-regressing activity, suggesting an antitumor role of HER263-71-specific CD8+ CTLs in this tumor control. Moreover, serum IFN- levels were significantly higher in the CT26/HER2 tumor-bearing mice than in the control mice. CT26/HER2 cells also expressed CD80. However, CD80-transfected 4T1.2/HER2 and CD80-non-expressing CT26/HER2 cells did not alter their tumorigenicity. A similar finding was observed in TC-1 and MC32 tumor models. Thus, these collective data show that, contrary to CT26/HER2 tumors, 4T1.2/HER2 tumors regress via induction of HER263-71-specific CD8+ CTLs, and that CD80 is not associated with the regression of these tumors. In the CT26/HER2 tumor model, HER2 DNA vaccines and even anti-PD-L1 abs failed to display antitumor therapeutic activity while inducing Ag-specific CTL activity. Moreover, tumor cells from tumor-bearing animals in the therapeutic model behaved similaly to wild type tumor cells in their HER2 expression, immune cell stimulation for IFN- production and antitumor immune sensitivity, suggesting that kinetic disparity between tumor cells and CTLs might be responsible for a lack of therapeutic tumor control. However, tumor cells from tumor-bearing animals in the prophylactic model obtained antitumor resistance by losing HER2 expression. Molecular-biological analyses demonstrated that HER2 expression is post-transcriptionally inhibited. Thus, this study shows that 1) immune selection pressure likely allows tumor cells to inhibit antigen expression post-transcriptionally, leading to tumor immune escape in the prophylactic model, and 2) kinetic disparity between tumor cells and CTLs might be responsible for a lack of therapeutic tumor control by HER2 vaccines. This is a new finding that immune selection pressure imposed by prophylactic HER2 vaccination can cause tumor cells to lose antigen expression post-transcriptionally, thus evading antitumor immunity. Taken together, the data from these two studies may contribute to better understanding of the mechanism(s) as to how antitumor immune responses are elicited and how tumor cells evade antitumor immune control. 종양면역반응을 연구하는데 종양동물모델은 유용하게 이용되고 있다. CT26/HER2 및 4T1.2/HER2 종양모델을 이용한 연구에서 보면, CT26/HER2종양세포는 동물에 종양을 형성 후 계속 성장하는 반면 4T1.2/HER2 종양세포는 종양형성 후 종양성장이 억제되는 양상을 보여 주었다. 본 연구의 첫째 부분에서는 이들 2개의 종양세포가 동물에서 왜 다른 반응을 보이는지 조사하였다. 4T1.2/HER2 종양이 완전히 억제된 동물에 다시 CT26/HER2 종양세포로 재차 주사 시 CT26/HER2 종양의 성장이 억제되는 것으로 보아 CT26/HER2 종양세포도 4T1.2/HER2 종양세포에 의해 유도된 항종양면역반응에 민감함을 보여준다. 또한, 4T1.2/HER2 종양을 가지는 동물의 면역세포를 얻어서 여러 종류의 HER2 MHC class I 펩타이드 중 특히 HER263-71 및 HER2342-350 항원과 자극했을 때 2배 이상의 IFN-를 분비하였다. 반면, CT26/HER2종양을 가지는 동물의 면역세포를 얻어서 이들 펩타이드와 자극 시 항원 비특이적으로 월등히 높은 수위의 IFN-를 분비하였다. 또한, CT26/HER2 종양을 가지는 동물과 달리 4T1.2/HER2 종양을 가지는 동물에서만 HER263-71 특이적 CTL작용이 탐지되었다. 더불어, 4T1.2/HER2 종양을 가지는 동물에서 CD8+ T 세포를 선택적으로 제거 시 종양억제효과가 사라졌다. 이는 HER263-71 특이적 CD8+ CTL이 종양억제에 직접적으로 관여하는 면역세포임을 의미한다. 반면, 4T1.2/HER2 종양을 가지는 동물과 비교해서, CT26/HER2 종양을 가지는 동물에서 혈청 IFN- 량이 훨씬 높게 탐지되었고 CT26/HER2 종양세포 표면에서만 CD80의 발현이 탐지되었다. 후속연구에서, CD80를 발현시킨 4T1.2/HER2 종양세포 및 CD80발현이 억제된 CT26/HER2 종양세포를 동물에 주사 시 원래의 종양세포가 보이는 종양형성양상과 차이가 탐지되지 않았다. 이러한 특성은 TC-1 및 MC32 동물모델에서도 유사하게 탐지되었다. 이들 연구결과는 CT26/HER2 종양에 비교해서, 4T1.2/HER2 종양은 성장하면서 HER263-71 특이적 CD8+ CTL를 유도하며 이들 면역세포군에 의해 자체적으로 종양이 억제되며 이때 CD80은 종양성장 및 억제에 아무 연관성이 없음을 증명한다. 본 연구의 둘째 부분에서는, CT26/HER2종양모델에서 HER2유전자백신과 anti-PD-L1항체의 종양치료효과를 조사하였다. HER2유전자백신의 주사에 의해 HER263-71 특이적 CD8+ CTL면역반응은 유도되었지만 종양의 치료효과는 탐지되지 않았다. 이들 종양이 치료되지 않는 동물에서 종양세포를 분리하여 조사해 본 결과 HER2 항원발현, 면역세포자극능력, 종양억제민감도에서는 원래의 CT26/HER2 세포와 별반 차이가 탐지되지 않았다. 이는 종양세포와 CTL사이의 성장속도의 차이가 HER2유전자백신이 종양치료효과를 보이지 못하는 원인일 것으로 추측된다. 반면, 종양예방모델에서도 HER2유전자백신에 의해 종양이 억제되지 않은 동물에서 종양세포를 분리하여 조사해본 결과, 이들 종양세포에서는 HER2항원발현이 탐지되지 않았다. 종양예방모델에서 얻은 종양세포들을 분자유전학적 방법을 통해 분석해본 결과, HER2종양항원발현이 억제되었고 이는 전사과정 이후에 항원발현이 억제되는 것으로 탐지되었다. 이들 연구를 기초로 해서 보면 1) 종양예방모델에서는 면역의 선택적 압력이 종양세포로 하여금 전사과정 이후의 조절과정에서 HER2항원발현이 억제되고 이들 항원발현의 소실을 통해서 CTL면역회피가 일어나며, 2) 종양치료모델에서는 종양세포와 CTL간의 성장속도의 차이에 기인하여 HER2유전자백신에 의한 항종양효과가 나타나지 않음을 보여 준다. 이들 연구결과는 종양항원특이 CTL면역반응의 유도 및 종양세포의 면역회피기전의 이해에 기여할 것으로 생각된다.

Structure-Activity Relationships of Berberrubine Derivatives for Antimicrobial and Antitumoral Activities

김성한 연세대학교 2001 국내박사

Antitumor Activity and Molecular Mechanism of Seleno-Psammaplin A Analogues and Piperazic Acid-bearing Cyclic Decapeptides

변웅섭 서울대학교 대학원 2021 국내박사

생리활성을 나타내는 천연물 유래 물질은 항균, 항암, 항염증 및 대사성 질환 둥 여러 질병에 대한 신약 개발과정에 있어 매우 중요한 자원으로 여겨져 왔다. 1940년대부터 현재까지 개발된 저분자(small molecule) 항암제 중 약 60%가 천연물이거나 천연물 유래 물질 이였다. 암은 식이 습관의 변화와 환경적 요인 그리고 수명 연장 등으로 그 발병률이 매년 증가하고 있는 추세이며, 외과적 수술요법과 항암화학요법 등을 통해 비교적 치료가 용이해진 초기암과는 다르게 진행성 암과 재발성 암에서는 기존 항암제에 대한 내성의 발생과 다른 장기로의 암의 전이가 빈번하여 암 치료에 있어서 가장 큰 난관이 되고 있다. 본 연구에서는 첫째, 유방암종에서 호르몬 수용체 (에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체) 및 HER2를 모두 발현하지 않아 기존의 항호르몬요법에 불응하는 삼중음성유방암을 효과적으로 치료할 수 있는 새로운 천연물 유래 화합물을 제시하고자 하였다. 최근 삼중음성유방암에서 DOT1L, G9a 등의 히스톤 메틸화 효소가 과발현되어 있으며 이에 따른 히스톤 라이신 잔기의 과다한 메틸화가 삼중음성유방암의 발생, 증식뿐만 아니라 전이까지도 매개한다고 보고되었다. 따라서 히스톤 메틸화 효소 (DOT1L, G9a) 활성 억제 효능 선도 물질을 발굴하고자, 해양 스펀지로부터 유래한 천연물인 psammaplin A 및 합성유도체 144종의 효능을 평가하여, 우수한 히스톤 메틸화 활성 저해능을 지닌 합성유도체 PsA-3091, HSPA-1012 및 SPA-1009를 도출하였다. 작용기전 연구를 통해 이들 물질의 삼중음성유방암에 대한 항암 및 항전이 효능이 히스톤 메틸화 효소의 활성 억제와 이에 따른 상피간엽이행(epithelial-mesenchymal transition, EMT) 지표의 조절에 의한 것임을 규명하였다. 둘째, 대장암은 전세계적으로 암 발병률 2위를 차지하며 최근 우리나라에서도 식이 습관의 서구화로 인하여 그 발병률이 빠른 속도로 증가하고 있는 실정이다. 그러나, 대장암의 치료에 일반적으로 사용되는 항암제인 5-fluorouracil (5-FU), oxaliplatin, irinotecan 등은 골수억제, 신경독성, 설사 등 심각한 부작용을 야기할 뿐만 아니라 장기간 사용에 따라 내성이 발생하는 문제가 있다. 이러한 부작용 경감 및 내성 발현을 효과적으로 억제할 수 있는 물질의 발굴은 항암제 개발의 중요한 영역중의 하나이다. 이에 piperazic acid를 함유하고 있는 물질들이 암세포에 대한 뛰어난 성장 저해 활성을 나타낸다는 최근의 보고에 착안하여 다수의 piperazic acid 함유 천연물에 대하여 항암 효능을 평가하였다. 이들 중 정상세포에 대한 독성은 낮으며 대장암세포의 성장을 효과적으로 억제하는 환상 펩타이드 구조의 천연물인 lenziamide A를 도출하였으며 작용기전연구를 통해 lenziamide A의 선택적 항암 효능이 STAT3 경로 매개 세포주기조절 및 세포사멸(apoptosis)의 유도에 의한 것임을 규명하였다. 또한, 5-FU 획득 내성 대장암 세포주에서 다제내성 유전자인 P-glycoprotein이 과발현되어 있음을 확인하였고, lenziamide A가 이를 효과적으로 저해함을 확인하였다. 나아가 5-FU 내성세포주를 이식한 마우스종양모델에 lenziamide A를 5-FU와 병용투여 하였을 때 종양성장 저해에 대한 상승효과(synergy effect)를 나타냄을 확인하였다. 대장암으로 인한 사망의 가장 큰 원인인 암의 다른 장기로의 전이 또한 lenziamide A의 투여에 따라 EMT 지표의 효과적인 조절과 함께 저해되었음을 확인하였다. 본 연구를 통해 삼중음성유방암의 성장과 전이를 효과적으로 조절할 수 있는 선도물질로써 psammaplin A의 신규 유도체 PsA-3091, HSPA-1012, SPA-1009를 제시하였다. 또한, piperazic acid 함유 환상 펩타이드 구조의 천연물인 lenziamide A의 항암 활성을 최초로 밝히고 나아가 대장암의 5-FU에 대한 내성 및 전이성을 효과적으로 조절할 수 있음을 확인하여 lenziamide A를 난치성 대장암 치료의 선도물질로 제시하였다. Globally, cancer is a major cause of human death, and the incidence is gradually increasing triggered by both environmental factors and dietary habits. According to the National Comprehensive Cancer Network guidelines, chemotherapy, radiation therapy, and resection surgery are considered the most common and effective strategies for the treatment of early-stage cancers. However, recurrence is observed within a few years after treatment, with the recurrence rate reaching up to 70% based on cancer types and stages. Moreover, recurrent cancers are known to be difficult to manage mainly due to their increased aggressiveness and metastatic potential caused by their resistance to previously treated drugs. Therefore, there is an urgent need to identify and characterize novel and effective strategies to treat patients with intractable cancer. Fortunately, a significant number of novel anticancer candidates originated from natural organisms are actively being reported. In particular, marine- or insect-derived natural sources are deemed significant in the excavation of unique chemical entities possessing potent bioactivities against a wide range of human diseases. The first part suggests that novel marine-derived natural products can effectively treat triple-negative breast cancer (TNBC), the cells of which do not express both hormone receptors (estrogen receptor and progesterone receptor) and human epidermal growth factor receptor. TNBC is characterized by frequent disease recurrence and metastasis despite standard chemotherapy with anthracyclines and taxanes. Aberrant methylation of histone H3 lysine 79 residues (H3K79me) mediated by the histone methyltransferase disruptor of telomeric silencing 1-like (DOT1L) is a potential therapeutic target for mixed-lineage leukemia (MLL)-rearranged leukemia. However, the relationship between DOT1L activity and TNBC remains to be further elucidated, as pre-developed nucleoside-structured DOT1L inhibitors are not sufficient for effective inhibition of growth and metastasis of TNBC cells. It was found that TNBC cells had high expression levels of DOT1L and low expression levels of E-cadherin compared with normal breast epithelial cells and non-TNBC cells. Here, synthetic analogues of the marine-derived natural product psammaplin A (PsA) exhibited remarkable inhibitory activity against DOT1L-mediated H3K79 methylation. Consistently, the PsA analogues also significantly inhibited the proliferation, invasion, and migration of TNBC cells along with the regulation of EMT biomarkers. In an orthotopic mouse metastasis model, these analogues effectively inhibited lung metastasis and tumor growth by regulating DOT1L activity and EMT biomarkers. Taken together, a new template of DOT1L inhibitor was reported and suggested that targeting DOT1L-mediated H3K79 methylation by novel PsA analogues may be a promising therapeutic strategy for the treatment of metastatic TNBC patients. The second part describes a novel piperazic acid-bearing cyclic peptide isolated from dung beetle-derived actinomycetes that can effectively inhibit the growth and metastasis of aggressive colorectal cancer (CRC). CRC is one of the most common cancers worldwide, with 1.8 million new cases being reported in 2018, and the third most cause of cancer-related mortality regardless of sex. Although combination therapies such as FOLFOX (leucovorin + 5-fluorouracil + oxaliplatin) and FOLFIRI (leucovorin + 5-fluorouracil + irinotecan) are commonly used to treat patients with CRC, these conventional agents often acquire resistance within a year of administration; this drug resistance is the primary reason for treatment failure. Therefore, novel strategies to treat patients with convoluted CRC are urgently needed. Piperazic acid-bearing natural products have demonstrated various biological activities, including antibacterial, antifungal, antiviral, antimalarial, and anticancer activities. Some of these uniquely structured compounds exhibit high cytotoxicity against human cancer cells in vitro; however, their underlying molecular mechanisms and associated in vivo antitumor activities are largely unexplored. In the continuous efforts to procure effective anticancer agents against CRC, the anticancer activity of six piperazic acid-bearing natural products was evaluated and identified three compounds with promising anticancer activities against a panel of CRC cells. Among the isolated compounds, lenziamide A, a cyclic decapeptide isolated from Onthophagus lenzii-derived Streptomyces sp. PC5, was identified as the most potent anticancer agent candidate with relatively low cytotoxicity against human normal cells. Studies on the underlying molecular mechanism of action have revealed that lenziamide A induces G2/M phase cell cycle arrest and subsequently evokes apoptotic cell death in CRC cells. The induced cell cycle arrest and apoptosis were correlated with the regulation of the STAT3 signaling pathway. Lenziamide A was also found to exhibit antitumor activity in an in vivo animal model and overcame 5-fluorouracil drug resistance in resistant CRC cells. In addition, lenziamide A effectively suppressed metastasis by regulating EMT in an orthotopic mouse metastasis model. These findings suggest that lenziamide A may be prioritized as a potential anticancer lead compound for the treatment of intractable CRC.

Antitumor Mechanisms of an Evodiamine analogue and Periplocin in Gemcitabine-Resistant Pancreatic Cancer Cells

배은서 서울대학교 대학원 2023 국내박사

The incidence and mortality of pancreatic cancer are gradually increasing, while the incidence of other common cancers have been declining. According to cancer statistics, pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) ranks the fourth leading cause of cancer-related death worldwide, and the survival rate has not increased significantly because of late diagnosis, anatomical location of pancreas, and limited reaction to chemotherapy. Despite development of early diagnosis approach and management of pancreatic cancer (PC), most of the patients have no choice to overcome pancreatic cancer and only under 5% of PC patients can live over 5 years. The first line treatment drug for PC is gemcitabine, which is the nucleoside analog targeting DNA synthesis inhibition. In addition, gemcitabine-based combination therapy is commonly preferred to treat patients with PC. Although gemcitabine-based chemotherapy is common and effective for pancreatic cancer (PC), acquired drug resistance is one of the major reasons for treatment failure. Therefore, a novel therapeutic approach for gemcitabine-resistant PC is required. The first part describes the mechanism of gemcitabine resistance and antitumor activity of evodiamine analogue. In cancer cells, Protein Kinase C (PKC) plays an important role in multiple signal transduction pathways including cell proliferation, tumorigenesis, cell adhesion, differentiation and apoptosis. Among the PKC isozymes, PKC βΙ is particularly involved in drug resistance mechanism and considered as a therapeutic target. The relationship between PKC βΙ and drug resistance remains to be explored. We found that gemcitabine-resistant PC cells had high expression of PKC βΙ. Evodiamine, a β-carboline alkaloid, is one of the major compounds isolated from the fruits of Evodia rutaecarpa and is reported to be a potent antitumor agent. Based on various biological activities of evodiamine, the design and synthesis of novel evodiamine analogues have been tried to develop potential druggable candidates. Synthetic analogues of evodiamine exhibited antiproliferative and inhibitory activity of PKC βΙ. In addition, PKC βΙ knockdown can overcome gemcitabine resistance in PC cells and evodiamine analogue can effectively inhibit tumor growth in a xenograft model. Taken together, a PKC βΙ inhibitor was reported and suggested that targeting PKC βΙ can overcome drug resistance and may be a potential approach to treat gemcitabine-resistant PC patients. The second part describes that periplocin, a cardenolide cardiac glycoside, has antitumor activity in gemcitabine-resistant PC by modulating redox conditions. Redox status is related to chemoprevention effect and is the main indicator in cancer cell adaptation to chemotherapy. It can be affected by drug resistance and one of the crucial regulators is Nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2). Currently, many evidence suggest that Nrf2 has ambilaterality characteristics in chemoprevention and chemoresistance. We investigated the role of Nrf2 in drug resistance and found that Nrf2 was overexpressed in gemcitabine-resistant cells, and Nrf2 knockdown recovered gemcitabine sensitivity in PANC-GR cells. The antiproliferative activity of periplocin was related to the Nfr2-mediated signaling pathway in PANC-GR cells. Moreover, increasing the generation of reactive oxygen species (ROS) can induce cell cycle arrest and cell death. Periplocin and gemcitabine combined significantly inhibited tumor growth in a PANC-GR cells-implanted xenograft mouse model via Nrf2 regulation. Therefore, these findings suggest that periplocin might be a novel therapeutic agent overcoming gemcitabine resistance by regulating Nrf2-mediated signaling pathways in gemcitabine-resistant PC cells. 암은 서구화된 식이 습관의 변화와 환경적 요인 등으로 인해 발병률이 매년 증가하고 있는 추세이며, 외과적 수술요법과 항암화학요법 등을 통해 비교적 치료가 용이해진 초기암과는 다르게 진행성 암에서는 기존 항암제에 대한 내성 및 전이 현상이 빈번하게 발생하고 있다. 특히, 췌장암은 조기 진단이 어려워 발병률 대비 사망률이 높은 암 종으로, 치료하기 위한 약물이 부족한 실정이며, 발견 당시 약물에 대한 획득 내성이 생기는 문제점이 있다. 본 연구에서는 첫째, 젬시타빈 내성 췌장암 세포주를 연구모델로 구축하여 젬시타빈에 불응하는 췌장암을 효과적으로 치료할 수 있는 새로운 천연물 유래 화합물을 제시하고자, 천연물 유래 evodiamine 합성 유도체의 효능을 평가하였다. 또한, 젬시타빈 내성에 관한 신규 바이오마커 도출을 위해 유전자 분석을 진행하여 PKCβΙ을 도출하였고, evodiamine 합성 유도체 중 우수한 활성을 지니는 Evo 412을 선별하여 작용기전 연구를 진행하였다. PKCβΙ이 젬시타빈 내성과 연관되어있음을 파악하고 Evo 412 물질의 저해활성을 파악하여 마우스 종양 모델에서 검증하였다. 둘째, 강심배당체를 함유하고 있는 천연물 유래 화합물의 암세포에 대한 뛰어난 성장 저해 활성을 나타낸다는 최근의 보고에 착안하여 periplocin에 대하여 항암 효능을 평가하였다. 이들 중 Nrf2 저해제로 알려진 물질의 작용기전을 근거로 periplocin의 항암 효능 및 내성극복 기전이 Nrf2 매개 경로임을 규명하였다. 또한, 세포내 ROS를 축적시킴으로써 세포 사멸을 유도하는 경로로 암의 비정상적인 증식을 억제하고 나아가 젬시타빈 내성세포주를 이식한 마우스종양모델에 periplocin을 젬시타빈과 병용투여 하였을 때 종양성장 저해에 대한 synergy effect를 나타냄을 확인하였다. 본 연구를 통해 젬시타빈 내성 췌장암의 성장을 효과적으로 조절하는 선도물질로써 evodiamine 유도체 Evo 412 물질 및 강심배당체 함유 천연물인 periplocin을 제시하였다. 또한, 내성을 극복하기 위한 전략으로 바이오 마커를 도출하고 물질의 작용기전을 파악하였다.

Ⅰ. Synthesis and Structure-Activity Relationship of Quinolinediones & Quinoxalinediones, Ⅱ. Synthesis and Antitumor Activity of Pyrazolo-pyrimidines as potent inhibitors of the CDK or Tyrosine Kinase

윤은영 서강대학교 대학원 1999 국내박사

Part Ⅰ. Synthesis and Structure-Activity Relationship of Aziridinylquinolinediones&Aziridinylquinoxalinediones. 여러 가지 다양한 aziridinylquinolinedione계열과 aziridinylquinoxal-inedione계열 화합물은 6,7-dichloro-5,8-quinolinedione과 6,7-dichloro-5,8-quinoxalinedione을 각각 출발물로 하여 합성하였다. 즉, 5,8-quinolinedione의 6번 또는 7번 위치에 2-methylaziridine 또는 aziridine을 도입하고, 다른 한 위치에 chlorine, carbamate, azide, amine, 또는 methoxy 등의 치환기를 도입하였다. 그리고 이들의 항암활성 검사는 human solid tumor cell line인 A549, SK-OV-3, SK-MEL-2, XF498, HCT15에 대해서 실시했다. 그 결과, aziridinylquinolinedione계열 화합물의 항암효과가 aziridinylquinoxal-inedione계열 화합물보다 우수했으며 항암효과가 가장 뛰어난 화합물은 6-amino-7-aziridinylquinolinedione이었다 이 화합물은 기준물질인 mitomycin C과 doxorubicin보다 항암효과가 더 우수하였다. 화합물 74, 83 그리고 98의 마우스에 대한 단회투여 복강독성시험을 실시했으며, 화합물 74와 98은 항암제인 doxorubicin보다 독성이 적었고 화합물 83은 높은 독성을 나타내었다. Part Ⅱ. Synthesis and Antitumor Activity of Pyrazolopyrimidines as potent inhibitors of the CDK or Tyrosine Kinase. 이 합성은 pyrazole 고리를 먼저 형성하고 다음에 pyrimidine 고리를 형성하는 과정으로 이루어졌다. Pyrazolo[3,4-d]pyrimidines를 합성하는데 있어서 중요한 중간체인 4-chloro-6-methylmercaptopyrazolo-(3,4-d)pyrimidine (122)은 ethoxymethylenemalononitrile를 출발물로하여 합성하였다. CDK 또는 tyrosine kinase의 억제제로서 여러 가지 다양한 pyrazolo[3,4-d]pyrimidines은 중간체 122의 C-4, C-6 그리고 N-1위치에 치환반응과 mitsunobe 반응에 의하여 다양한 치환기를 도입하여 준비하였다. 그리고 이들의 항암활성 검사는 human solid tumor cell line인 A549, SK-OV-3, SK-MEL-2, XF498, HCT15에 대해서 실시하였다. 기준물질인 olomucin의 ED_(50)치와 비교했을 때 4-benzylamino-1-(2-propry)-6-(2-hydroxy-methylamino)-pyrazolo[3,4-d]pyrimidine (129)은 olomucin보다 더 우수한 항암활성을 나타내었다. Part Ⅰ. Synthesis and Structure-Activity Relationship of Aziridinylquinolinediones & Aziridinylquinoxalinediones. Various aziridinylquinolinediones and aziridinylquinoxalinediones were prepared starting from 6,7-dichloro-5,8-quinolinedione and 6,7-dichloro-5,8-quinoxalinedione, respectively. Aziridinylquinolinediones and aziridinylquinoxalinediones were prepared by the introduction of aziridine or 2-methylaziridine at the 6- or 7-position of 5,8-quinolinedione with various substitutents such as chlorine, carbamate, azide, amine, or methoxy group at the other position. Their antitumor activity was tested in vitro against A549 (human lung), SK-OV-3 (human ovarian), SK-MEL-2 (human melanoma), XF498 (human CNS), and HCT15 (human colon) cell lines. The results of the test of antitumor activity were shown that the aziridinylquinolinediones were generally more active than the corresponding aziridinylquinoxalinediones. The most active compound of the tested compounds was 6-amino-7-aziridinylquinolinedione 91. It was more active than thestandard materials, mitomycin C and doxorubicin. Toxicity test was performed in ICR mice injected intraperitoneally with 74, 83, 98. LD_(50)'s for 74 and 98 were acceptable high values (less toxic than doxorubicin), but 83 was highly toxic. Part Ⅱ. Synthesis and Antitumor Activity of Pyrazolopyrimidines as potent inhibitors of the CDK or Tyrosine Kinase. This synthesis was performed by the pyrazole ring formation followed by the pyrimidine ring formation. 4-Chloro-6-methylmercaptopyrazolo[3,4-d]pyrimidine (122) as a key intermediate for synthesis of pyrazolo[3,4-d]pyrimidines was synthesized starting from ethoxymethylenemalononitrile. Various pyrazolo[3,4-d]pyrimidines as potent inhibitors of the CDK or tyrosine kinase were prepared by introducing various substitutents using substitution and mitsunobe reaction at C-4, C-6, and N-1 in 122. Their antitumor activity was tested in vitro against A549 (human lung), SK-OV-3 (human ovarian), SK-MEL-2 (human melanoma), XF498 (human CNS), and HCT15 (human colon) cell lines. Compared with ED_(50)'s for olomucin as a standard material, we could confirm that 4-benzylamino-l-(2-propry)-6-(2-hydroxymethylamino)pyrazolo[3,4-d]pyrimidine (129) was more active than olomucin.

Antitumor Effect of Reticulol from Streptoverticillium sp. NA-4803

임대석 Graduate School of Konkuk University 2003 국내박사

본 연구는 방선균 streptoverticillium sp. NA-4803 으로부터 분리된 reticulol의 항암효과를 조사한 내용으로써, 실험전반에 걸쳐 B16F10 melanoma를 대상으로 수행되었다. 분리된 reticulol은 폐종양세포주, A427 및 흑색종세포주, B16F10에 대해서 강한 항종양활성을 나타내었으며 B16F10 세포주에 대해 trypan blue staining assay를 수행한 결과 reticulol 처리에 의한 세포생존률이 200 μM 농도에서 현저하게 감소하였다. B16F10 melanoma를 전이시킨 마우스에 정맥주사된 reticulol은 50 mg/kg의 처리농도에서 폐에 전이된 종양집락의 수를 현저하게 감소시켰으며, 대조군의 마우스와 비교하여 90%의 생존률을 나타내었다. Reticulol은 복강투여하였을 경우 정맥 주사했을 때 보다 약한 종양의 폐전이 억제효능을 보였다. 한편, reticulol의 종양전이 억제효과는 종양전이에 연관된 효소, matrix metalloproteinase-2 또는 -9 세포고사 (apoptosis)와 전혀 관계가 없는 것으로 추론되었다. 결론적으로 phosphodiesterase 억제제로 알려진 reticulol은 B16F10 흑색종에 대해 세포괴사 (necrosis)에 의한 직접적 손상을 야기시켰으며, 그로 인해 혈류를 통한 종양의 폐전이를 억제시킨 것으로 추정되었다. 상기의 결과에 기초하여 본 저자는 reticulol의 효소억제 효능과 세포독성을 조사하기 위하여 DNA topoisomerase cleavage assay와 B16F10 흑색종을 이용한 in vivo 항암효능 검색을 수행하였다. 종양의 전이에 연관된 topoisomerase I에 대한 reticulol의 억제실험에서 45 μM 농도의 reticulol은 topoisomerase Ⅰ에 의한 supercoiled DNA의 relaxed DNA로의 변환을 억제하였다. Reticulol 200 μM의 농도에서 흑색종의 사멸형태를 조사하기 위한 Annexin V/PI 염색 실험결과 종양세포는 PI에만 염색되는 현상을 보이는, 즉 괴사반응을 나타내면서 증식이 저해되었다. 또한, B16F10 흑색종에 대한 reticulol의 in vivo 항암효능 실험결과, reticulol 처리군의 종양 성장은 대조군의 경우와 비교하여 더욱 지체되었다. 한편, reticulol을 현재 임상에서 사용중인 항암제, adriamycin과 병용 처리하였을 경우 (5 mg/kg의 reticulol과 1 mg/kg의 adriamycin 혼합물) adriamycin이 단독처리된 (1 mg/kg) 마우스의 종양과 비교하여 종양성장을 더욱 지연시켰으며 대조군과 비교하여 60%의 높은 생존률을 나타내었다. 결론적으로. reticulol은 종양전이에 관계하는 효소인 topoisomerase I을 불활성화시켰으며, 또한 reticulol을 adriamycin과 조합해서 투여하였을 때, B16F10 흑색종에 대해 우수한 in vivo 항암효능을 나타내었다. Reticulol was isolated from the culture broth of the strain Streptoverticillium sp. NA-4803. Reticulol (M.W. 222.2) exhibited a potent in vitro cytotoxicity against A427, a human lung tumor cell line, and B16F10, a mouse melanoma cell line. In the Trypan blue staining assay for B16F10 cells, the viability of reticulol-treated cells was significantly decreased in a dose-dependent manner. The In vivo assay for the lung metastasis-blocking effect showed that reticulol injected intravenously suppressed the increase in colonies on the lung in a dose-dependent manner. In addition, the survival rate of tumor-implanted mice treated with reticulol was closely associated with its antitumor effect. Intravenous injection of reticulol demonstrated more potent metastasis inhibitory activity than intraperitoneal challenge. On the other hand, the inhibitory effect of reticulol on matrix metalloproteinase-2 or 9 (MMP-2 or 9) involved in tumor metastasis was not observed . Moreover, the antitumor efficacy of reticulol was not found to be associated with cell-cycle arrest or apoptosis. Consequently, necrotic response demonstrated the probability of direct relationship between reticulol and B16F10 melanoma cell growth. These results suggest that reticulol protects metastasis to lung by inhibiting the growth of B16F10 melanoma at the cellular level.

차나무 종자 추출물의 항균활성 및 항종양활성

최재훈 건국대학교 대학원 2005 국내석사

영문초록:This study was carried out to investigate antimicrobial and antitumor activities of solvent extracts of seed and skin of Camellia sinensis L. Antimicrobial and antitumor activities were examined against 17 microorganisms and 6 human tumor cell lines, respectively.The results obtained were summarized as follows ;1. Extraction yields of seed and skin by 70% ethanol were 15.9 and 12.3%, respectively. Also extraction yields of seed and skin by water were 30.6 and 21.8%, respectively.2. Seed extract showed antifungal activities against Candida albicans IFO 1594 and Cryptococcus neoformans among tested yeast. 70% Ethanol extract of seed showed inhibition zone 20 mm against Candida albicans IFO 1594 at the concentration of 100 mg/mL.3. Antifungal activity of seed extract was not decreased by heating at 80 and 100℃ for 30 min and at 121℃ for 15 min, suggesting that the component in seeds was heat-stable. 4. Skin extract did not show anititumor activity, but seed extract showed growth inhibition effect on tumor cell lines. Water extract of seed were better on antitumor activity than 70% ethanol extract. 5. Antitumor activity of seed extract by water showed 98.6% in Farrow 98.4% in HEP-2, 98.3% in SK-OV-3, 98.2% in SW-156 and 98.0% in SK-MES-1 at the concentration of 500 μg/mL.6. From the result of growth inhibition effect of seed extract by water to tumor cell line SK-OV-3 and normal cell line NIH/3T3, tumor cells showed growth inhibition effect in over 70% and normal cells showed the growth inhibition effect in below 10% at 50 μg/mL. So seed extract by water showed selective toxicity to tumor cell line than normal cell line using MTT assay