식물의 스트레스 반응에 관여하는 RNA-결합 단백질과 microRNA의 기능 분석

김주열 전남대학교 대학원 2009 국내박사

In recent years, it has become increasingly apparent that posttranscriptional control of gene expression in eukaryotes is important in various cellular processes such as growth, development, and stress adaptation. Contrary to the increasing amount of knowledge regarding the functional roles of glycine-rich RNA-binding proteins (GRPs) and zinc finger-containing GRPs (RZs) in Arabidopsis thaliana in stress Es, the physiological functions of GRPs and RZs in rice (Oryza sativa) currently remain largely unknown. In this thesis, the functional roles of the gene family encoding OsGRPs and OsRZ from rice were investigated under cold or freezing stress conditions. Among the six OsGRPs and three OsRZs investigated, OsGRP1 (Os01g68790), OsGRP4 (Os04g33810), OsGRP6 (Os12g31800), and OsRZ2 (Os07g08960) were shown to have the ability to complement cold-sensitive BX04 E. coli mutant cells under low temperature conditions, and this complementation ability was correlated closely with their DNA- and RNA-melting abilities. Moreover, OsGRP4 and OsRZ2 complemented the cold-sensitive phenotypes of grp7 mutant plants, in which the expression of AtGRP7, one of the eight GRPs in Arabidopsis, was suppressed and is sensitive to cold and freezing stresses. Considering that AtGRP7 confers freezing tolerance in plants and harbors RNA chaperone activity during the cold adaptation process in E. coli, the results of the present study provide evidence that GRPs in rice and Arabidopsis are functionally conserved, and also suggest that GRPs perform a function as RNA chaperones during the cold adaptation processes in monocotyledonous plants, as well as in dicotyledonous plants. In recent years, the researches on microRNAs (miRNAs) as an important regulator in RNA metabolism are increasing, but the regulatory roles of miRNAs in plant stress responses are largely unknown. In this thesis, the expression and functional roles of four microRNAs including miR395c, miR395e, miR402, and miR414 were investigated in Arabidopsis plants subjected to a variety of stress conditions. The miRNAs investigated in this thesis have been predicted to regulate the expression of several target mRNAs; miR395c and 395e for ATP sulfurylase and sulfate transporter, miR402 for DNA glycosylase (DEMETER) and ATP-dependant helicase, and miR414 for diverse groups of mRNAs. The transgenic Arabidopsis plants that constitutively overexpress miR395c or miR395e survived better than the wild-type plants under sulfate starvation conditions. Overexpression of miR395c retarded the germination of Arabidopsis plants under high salt or dehydration stress conditions, whereas overexpression of miR395e accelerated the germination of the plants under the same stress conditions. Considering that miR395c and miR395e differs each other at only one nucleotide position, these results demonstrate that a single nucleotide difference in a particular family of miRNA can guide the cleavage of different mRNA targets and perform a function as a positive or negative regulator of seed germination in Arabidopsis plants under stress conditions. Analysis of the transgenic Arabidopsis plants showed that miR414 negatively affects the seed germination of the plants under salt stress and ABA treatment conditions, while miR402 positively affects the seed germination and seedling growth of the plants under salt or dehydration stress and ABA treatment conditions. The results of the present study provide a basis for further investigation of the regulatory roles of miRNAs in the responses of plants to a variety of stress conditions. 최근 진핵 생물에서 유전자 발현의 전사후 조절이 생장, 생육과 스트레스 순응과 같은 다양한 과정에 중요하다는 것이 점차적으로 명백해지고 있다. 애기장대에서 스트레스에 반응하는 glycine-rich RNA-결합 단백질(GRPs)과 zinc-finger를 포함하는 GRPs(RZs)의 기능적인 역할에 대한 정보는 증가하고 있으나, 벼의 GRPs와 RZs의 생리적인 기능은 현재 거의 알려지지 않은 상태이다. 본 논문에서는 벼에 존재하는 O_(s)GRPs와 O_(s)RZs 유전자들의 저온 및 동결 스트레스 내성 과정에서의 기능적인 역할을 연구하였다. 연구한 6개의 O_(s)GRPs와 3개의 O_(s)RZs중에 O_(s)GRP1 (O_(s)01g68790), O_(s)GRP4 (O_(s)04g33810), O_(s)GRP6 (O_(s)12g31800)과 O_(s)RZ2 (O_(s)07g08960)가 저온에 민감한 대장균 BX04 변종세포의 저온에서의 생육을 보완하는 능력을 보였고, 이 보완능력은 각 유전자들이 DNA와 RNA를 풀어주는 능력과 밀접한 상호관계를 나타냈다. 또한, O_(s)GRP4와 O_(s)RZ2는 애기장대의 8개 GRPs 유전자중 하나인 AtGRP7의 발현이 억제되어 저온과 동결 스트레스에 민감한 grp7 돌연변이체의 저온 민감성 표현형을 보완하였다. AtGRP7이 식물에 동결 내성을 부여하고 대장균의 저온 순응과정 동안 RNA 샤페론 활성을 가지고 있는 점을 고려하면, 본 연구 결과는 벼와 애기장대의 GRP가 기능적으로 보존되어있다는 증거이며, GRPs가 쌍자엽식물 뿐만 아니라 단자엽식물에서도 저온 순응과정동안 RNA 샤페론으로서 기능을 수행함을 제시한다. 다른 연구에서는 다양한 스트레스 조건하의 애기장대 식물체에서 miR395c, miR395e, miR402과 miR414 등 4개의 microRNAs (miRNAs)의 발현과 기능적인 역할을 연구하였다. 이 논문에서 연구된 miRNAs는 몇 개의 표적 mRNA의 발현을 조절하는 것으로 예상된다; miR395c와 395e는 ATP sulfurylase와 sulfate transporter를, miR402는 DNA glycosylase (DEMETER)와 ATP-dependant helicase를, 그리고 miR414는 다양한 mRNA를 조절할 것으로 예상된다. miR395c와 miR395e를 과발현 시킨 형질전환 애기장대는 황 결핍 조건에서 야생종보다 더 잘 생존하였다. miR395c의 과발현은 고염분과 건조 스트레스 조건에서 애기장대의 발아를 저해시켰고, 반면에 miR395e의 과발현은 같은 스트레스 조건에서 식물체의 발아를 가속시켰다. miR395c와 miR395e가 오직 하나의 nucleotide가 다르다는 점을 고려할 때, 이 결과는 miRNA의 특정한 집단에서 하나의 nucleotide의 차이 때문에 다른 mRNA 표적의 절단을 유도할 수 있으며, 스트레스 조건하에서 애기장대 종자 발아의 positive 또는 negative 조절자로서 기능을 수행할 수 있음을 증명한다. 형질전환 애기장대의 분석 결과, miR414는 염분 스트레스와 앱시스산 처리 하에서 식물체의 종자 발아를 저해 하였으나, 반면에 miR402는 염분 또는 건조 스트레스와 앱시스산 처리 하에서 식물체의 종자 발아와 유식물 생장을 촉진하였다. 본 연구는 다양한 스트레스 에 반응하는 식물체에서 이러한 miRNA의 역할을 더 깊이 이해하는데 필요한 토대를 제공하였다.

형질전환 식물체와 knock-out 돌연변이체 분석을 통한 애기장대의 TIP4:1 단백질 기능에 관한 연구

정문수 전남대학교 대학원 2007 국내석사

식물체가 생존하기 위하여 적절한 수분 획득과 이동은 필수적인 조건이다. Aquaporin은 수분 수송 관련 단백질 그룹이며, 이러한 aquaporin 중에서도 Tonoplast intrinsic protein 4:1 (TIP4:1)은 액포막에 존재한다고 보고되어져 왔다 (Liu et al., 2003). 액포막은 이온 항상성과 pH 조절 기능에 중요한 역할을 하며, 최근에 TIP4:1 단백질은 요소 단백질 수송체로서 세포내의 소기관 사이에 요소 농도를 최적 농도로 유지하는 역할일 것으로 제안하고 있으나, 기능은 거의 밝혀지지 않았다. 애기장대에서 TIP4:1 단백질의 기능을 연구하기 위하여, 1.5 kb의 TIP4:1 프로모터와 CaMV35S 프로모터를 이용한 형질전환 식물체 및 T-DNA가 삽입된 knock-out 돌연변이체를 제작, 선별하였다. GUS를 이용한 조직 화학적 분석과 Western blot 분석을 통하여, TIP4:1 유전자 및 단백질은 주로 뿌리에서 발현됨을 확인하였고, 지속적인 명상태 조건 하에서 어린 식물체 발달 단계의 표현형을 관찰한 결과, knock-out 돌연변이체의 하배축 길이가 wild-type 및 과발현 형질전환체 보다 길어짐을 알 수 있었다. 또한 각 식물체들을 AgNO3가 첨가된 배지 조건 하에서 10일 동안 뿌리 생장을 조사한 결과, knock-out 돌연변이체의 뿌리 길이가 억제됨을 알았고, 수경재배 조건에서는 식물체의 생장이 촉진된다는 것을 관찰하였다.

애기장대 전사활성인자 MBF1a의 과발현 형질전환체로부터 비생물학적 및 생물학적 스트레스 내성 연구

김민정 전남대학교 대학원 2007 국내석사

We conducted a yeast genetic screening to identify salt tolerance (SAT) genes in a maize kernel cDNA library. During the screening, we identified a maize clone (SAT41) that seemed to confer elevated salt tolerance in comparison to control cells. SAT41 cDNA encodes a 16-kDa protein which is 82.4 % identical to the Arabidopsis Multiprotein bridging factor 1a (MBF1a) transcriptional coactivator gene. To further examine salinity tolerance in Arabidopsis, we functionally characterized the MBF1a gene and found that dehydration as well as heightened glucose (Glc) induced MBF1a expression. Constitutive expression of MBF1a in Arabidopsis led to elevated salt tolerance in transgenic lines. Interestingly, plants overexpressing MBF1a exhibited insensitivity to Glc and resistance to fungal disease. Our results suggest that MBF1a is involved in stress tolerance as well as in ethylene and Glc signaling in Arabidopsis.

애기장대의 생장과 스트레스 반응에 관여하는 non-coding RNA의 발현과 기능 분석

정현주 전남대학교 대학원 2007 국내석사

Recent computational analysis of expressed sequence tags and expression analysis in plants revealed a variety of non-coding RNAs that are transcribed but not translated to functional proteins. Non-coding RNAs are classified into three groups; small open reading frame RNAs (sORF RNAs), microRNAs (miRNAs), and short-interfering RNAs (siRNAs). Small ORF RNAs are several hundreds to thousands nucleotides-long mRNAs that contain several coding regions producing less than 100 amino acid-long peptides. miRNAs and siRNAs are 20 to 25 nucleotides-long RNA transcripts that have an ability to bind complementary mRNAs, thereby suppress target gene expression by either mRNA cleavage or translational repression. Although many recent reports propose that non-coding RNAs play diverse roles in growth, development, morphogenesis, and stress responses of plants, the biological roles of different types of non-coding RNAs remain to be elucidated. In this thesis, one sORF RNA designated AtGUT15 and one miRNA designated miRNA417 were investigated for their tissue-specific and stress-responsive expression patterns and the functional roles in seed germination and seedling growth of Arabidopsis thaliana under normal growth or various abiotic stress conditions. AtGUT15 and miRNA417 are expressed through all growth stages and ubiquitously in all organs including stems, roots, leaves, and flowers. The expression of AtGUT15 and miRNA417 was moderately regulated by cold, drought, or salt stress and by ABA treatment. Loss-of-function mutants of AtGUT15 displayed a much faster bolting compared to wild-type plants under normal growth conditions, implying that AtGUT15 may be involved in regulating bolting time in Arabidopsis plants. To prove the biological roles of miRNA417, transgenic Arabidopsis plants that constitutively overexpress miRNA417 under the control of cauliflower mosaic virus 35S promoter were generated and their phenotypes were analyzed under normal and stress conditions. Results showed that overexpression of miRNA417 had no effect on growth and development of Arabidopsis plants under normal growth conditions. However, seed germination and seedling growth of the transgenic plants were retarded compared with the wild-type plants in the presence of high salt or ABA. These results imply that miRNA417 plays a role as a negative regulator of seed germination in Arabidopsis plants under salt stress. No cleavage of the putative targets for miRNA417 was observed by the overexpression of miRNA417 in the transgenic plants, suggesting that miRNA417 exerts its role by translational suppression mechanism.

지베렐린 반응 전사인자 애기장대 AtSAT32 유전자의 염해 내성에 대한 연구

박민영 전남대학교 대학원 2007 국내석사

During a genetic yeast screening to identify salt tolerance (SAT) genes in a maize kernel cDNA library, we identified a maize clone, designated SAT32, that seemed to confer elevated salt tolerance in yeast cells. Based on the amino acid sequence of SAT32, the Arabidopsis homolog of SAT32, designated AtSAT32, was isolated. AtSAT32 is approximately 40% identical to SAT32 in amino acid sequence, and is 48 kDa in size. To further examine the roles of AtSAT32 in salinity tolerance in Arabidopsis, we functionally characterized AtSAT32 and found that salinity induced AtSAT32 expression. Constitutive expression of AtSAT32 in Arabidopsis led to elevated salt tolerance in transgenic lines. Interestingly, loss-of-function mutant of AtSAT32 exhibited insensitivity to gibberellin (GA). We propose that AtSAT32 is involved in salt stress tolerance as well as in mediating the control of plant root development by GA hormone.