Development of biosurfactant production process in Bacillus subtilis strains using citrus peel

이병만 인하대학교 대학원 2024 국내박사

Citrus peels are a by-product of citrus juice manufacturers processing fresh citrus fruits into juice, and make up about 40% of the total weight of the raw materials. As of 2022, about 50,000 tons of citrus peels, which are discarded peels and by-products after making citrus juice, are generated, and with ocean dumping banned, a cost of about 1.2 billion won is being spent every year to dispose of them. Since citrus peels are released immediately after the juice is squeezed out during the processing process, their use is limited due to their high moisture content and low pH. However, citrus peels contain many effective bioactive substances such as vitamin C, flavonoids, carotenoids, and pectin. A variety of research is being conducted to utilize these citrus peels and convert them into high value-added materials. Currently, it is being used as eco-friendly livestock feed, feed additives, mushroom media, etc., but its usage is limited. Biosurfactant is generally a common term for surfactants derived from living organisms, but in the research field, it refers to amphipathic lipids produced outside the cell by microorganisms. Research on biosurfactants began in the 1960s and has expanded into fields such as nanotechnology and life science, starting with research related to the application of eco-friendly surfactants. These biosurfactants are largely classified according to the type of hydrophilic group, and according to the origin and chemical composition of the microorganisms from which they are commonly produced. Chemical surfactants produced in petrochemical and oleochemical industries have environmental and safety problems, while biosurfactants produced from microorganisms have advantages such as low toxicity, easy biodegradability, and mild production conditions, making them suitable for use in traditional petrochemicals. However, problems such as the high production cost of biosurfactants, low potency, and limitations in applicable fields are limiting their industrialization. Recently, as technology and processes have developed, active research is being conducted on some biosurfactants that satisfy economic feasibility for industrialization. Bacillus strains are generally recognized as safe and have various advantages such as fast growth rate and high protein secretion ability, so they are widely used in the biotechnology industry. In particular, it is known as a strain that can produce useful biosurfactants such as surfactin and iturin, but its production cost is high and its production yield is low, which limits its industrialization. Therefore, the development of processes that can produce high yield biosurfactants at low production costs is an essential process for industrialization. Additionally, form an economic perspective, it appears necessary to develop mass production technology to achieve price competitiveness. Skin penetration testing methods are divided into two types: in vivo testing and in vitro testing. The in vivo test method has the advantage of obtaining general information about systemic circulation and metabolism, but it is difficult to distinguish the initial permeation stage because it requires the use of live animals. In addition, the skin of mice or pigs which are used in experiments is different from actual human skin due to species specificity, so the result values for human skin are different. The in-vitro skin permeation test is a method of measuring the amount of a test substance that moves through the reconstructed human skin or the skin of other species. This method allows repeated measurements of the test substances, and allows the penetration conditions to be determined without using experimental laboratory animals. And also, the range of test substances that can be used is wide, and it has the advantage of being able to study the relationship between skin damage and skin permeation, which cannot be evaluated by in vivo testing for ethical reasons. And also, the in vitro skin permeation test can compare the permeability according to the composition of the substance, so it can be used as a useful model for assessing risks due to skin permeation in the human body. The skin permeability measurement system newly designed in this research is a system that automatically removes air bubbles that may occur during the experiment and measures the amount permeated through the skin in real time. During in vitro permeability tests, air bubbles that form in the permeable layer are considered the biggest problem in the reliability of test results. Additionally, air bubbles once formed cannot be removed during the test, and the skin and materials used in the test cannot be reused. For this reason, testers must be very careful in sampling and manipulation. Air bubbles may form when the tester places the test skin on the transparent surface of the Franz cell. In addition, according to the OECD test method guidelines, it is essential to measure the permeation concentration more than six times, so the tester must perform sampling from the Franz cell. This sampling process is the biggest factor in the injection of air bubbles into the Franz cell. However, when this system is applied, air bubbles formed inside the Franz cell during testing under initial conditions enter the bubble trap through the circulation line, and when they enter the Franz cell again, the air bubbles are removed and do not enter again. This system allows sampling through the valve of the circulation line of the existing FPLC, and can easily recharge the buffer reduced due to sampling by adjusting the bubble trap. In addition, the transmission amount can be continuously measured through a UV detector during the test period, making it a suitable system for optimizing the delivery speed and method, which are important in drug delivery. In this study, the skin permeability improvement performance of biosurfactant produced through Bacillus fermentation was verified, and improved permeability was confirmed in both pig skin and artificial skin compared to the control group. The efficacy of the biosurfactant produced from the Bacillus strain using citrus peel developed through this study was verified, and more efficient and reliable results can be obtained by using an in vitro skin permeability system designed to remove air bubbles and measure permeability in real time. 감귤 가공업체가 감귤을 주스등으로 가공하는 과정에서 전체 중량의 약 40%가 감귤박으로 나옵니다. 2022년 기준 감귤주스를 만들고 난 뒤 버려지는 껍질과 부산물인 감귤박은 5만톤가량 발생하며 해양투기가 금지되면서 이를 처리하기위해 매년 약 12억원의 비용이 사용되고 있습니다. 감귤박은 가공과정에서 즙을 짜내고 바로 배출되는 형태이기 때문에 수분함량이 높고, pH가 낮아서 이용에 제한적입니다. 하지만 감귤박에는 비타민 C, 플라보노이드, 카르티노이드, 펙틴과 같은 유효한 생리활성 물질을 다수 포함하고 있으므로 이러한 감귤박을 활용하여 고부가가치 물질로 전환하기 위한 연구가 다양하게 진행되고 있습니다. 현재 친환경 가축사료와 사료첨가제, 버섯배지 등으로 제한적으로 사용되고 있지만 그 사용량이 한정적입니다. 바이오계면활성제는 통상적으로 생체 유래의 계면활성제를 총칭하고 있지만 연구분야에서는 미생물에 의해 균체 외에서 생산되는 양친매성 지질을 뜻합니다. 바이오계면활성제의 연구는 1960년대 시작으로 해서 친환경적인 계면활성제로의 응용에 관련된 연구를 시작으로 나노 기술이나 라이프사이언스와 같은 분야로 확대되고 있습니다. 이러한 바이오계면활성제는 크게 친수성기의 종류에 따라 구분되며, 통상적으로 생산되는 미생물의 기원과 화학조성에 따라 구별됩니다. 석유화학 및 유지화학에서 생산하는 화학 계면활성제는 환경적, 안전성에서 문제점이 있는 반면, 미생물로부터 생성되는 바이오계면활성제는 낮은 독성, 용이한 생분해성, 온화한 생산조건 등의 장점을 가지고 있어 전통적인 석유화학 계면활성제를 대체할 수 있을 것으로 기대되어지고 있습니다. 그러나 바이오계면활성제의 높은 생산원가, 낮은 역가 및 응용 가능분야의 한계 등의 문제점이 산업화에 제약을 주고 있습니다. 최근, 기술 및 공정이 발달됨에 따라 경제성이 충족되는 일부 바이오계면활성제에 대해 산업화를 위한 활발한 연구가 진행되고 있습니다. 바실러스 균주는 통상적으로 안전하다고 인정된 균주로서 성장속도가 빠르고 높은 단백질 분비능력과 같은 다양한 장점을 지니고 있어 생명공학산업 분야에서 널리 사용되어 지고 있습니다. 특히, surfactin과 iturin 등 유용한 바이오계면활성제를 생산할 수 있는 균주로 알려져 있으나 생산단가가 높은데 반해 생산수율이 낮아 산업화에 한계점을 가지고 있습니다. 그러므로 낮은 생산단가로 높은 수율의 바이오계면활성제를 생성할 수 있는 공정의 개발이 산업화를 위해 필수적인 과정입니다. 또한, 경제적인 관점에서 가격 경쟁력을 갖추기 위한 대량생산 기술 개발 역시 필요할 것으로 보입니다. 피부 투과 시험 방법은 생체 내 시험과 체외 시험의 두 가지 유형으로 구분됩니다. 생체내 시험법은 전신순환 및 대사에 관한 일반적인 정보를 얻을 수 있다는 장점이 있으나, 살아있는 동물을 사용해야 하므로 초기 투과단계를 구별하기가 어렵습니다. 그리고 실험에서 사용하는 쥐나 돼지 등의 피부는 종 특이성으로 인해 실제 인간피부와의 차이가 있어 인간피부에 대한 결과 값과는 차이가 있습니다. 체외 피부투과시험법은 피부를 통과하여 이동하는 시험물질의 양을 측정하는 방법으로 사람의 피부나 다른 종의 피부를 사용할 수 있고 시험물질의 반복측정이 가능하며, 실험동물을 사용하지 않고도 투과 조건을 연구하는 것이 가능합니다. 또한, 사용할 수 있는 시험물질의 범위가 넓고, 윤리적인 이유로 생체 내 시험으로는 평가할 수 없는 피부 손상과 피부 투과 사이의 관계를 연구할 수 있다는 장점이 있습니다. 뿐만 아니라, 체외 피부투과시험은 물질의 조성에 따른 투과도를 비교할 수 있어 인체 내 피부투과로 인한 위험성 평가에 유용한 모델로 활용될 수 있습니다. 이번 연구를 통해 새롭게 디자인한 피부 투과도 측정시스템은 실험과정에서 생길 수 있는 공기방울을 자동적으로 제거하고 피부를 통해 투과되는 양을 실시간으로 측정가능한 시스템입니다. 체외 투과도 시험 중 투과층에 생기는 공기방울은 시험결과 신뢰도에서 가장 큰 문제로 여겨지고 있습니다. 그리고 한번 형성된 공기방울은 시험 중 제거가 불가능하며 시험에 사용된 피부와 물질은 재사용이 불가능합니다. 이러한 이유로 시험자는 샘플링이나 조작에서 많은 주의를 요하고 있습니다. 시험자가 franz cell의 투과면에 시험용 피부를 장착할 때 공기방울의 형성될 수 있습니다. 또한 OECD 시험법 가이드라인 기준 6회 이상 투과농도 측정이 필수적으로 되어있어서 시험자는 franz cell에서 샘플링을 진행해야 하는데, 이러한 샘플링과정은 franz cell 내부로 공기방울이 주입되는 가장 큰 요인으로 작용하고 있습니다. 하지만 이 시스템을 적용하면 초기 조건에서 시험 중 franz cell 내부에 형성된 공기방울은 순환라인을 통해 버블트랩으로 들어가며, 다시 franz cell로 들어갈 때에는 공기방울이 제거되어 다시 들어가지 않게 되는 시스템입니다. 이 시스템은 기존의 FPLC가 가지고 있는 순환라인의 밸브를 통해 샘플링이 가능하고 버블트랩의 조절을 통해 샘플링으로 인해 감소된 버퍼를 간단하게 충전해줄 수 있습니다. 또한 시험기간동안 UV detector를 통해 지속적으로 투과량 측정이 가능하여 약물전달에서 중요한 전달속도와 방법을 최적화하는데 적합한 시스템으로 적용이 가능합니다. 본 연구에서 바실러스 발효를 통해 생산한 바이오계면활성제의 피부투과도 향상 성능을 검증하였고 돼지피부와 인공피부에서 모두 대조군대비 향상된 투과능을 확인할 수 있었습니다. 본 연구를 통해 개발된 감귤박을 이용한 바실러스 균주에서 생산된 바이오계면활성제 효능을 검증하였고, 공기방울 제거 및 실시간 투과도 측정 가능하도록 설계된 체외 피부 투과도 시스템을 이용하면 보다 효율적이고 신뢰도 있는 결과를 도출할 수 있을 것입니다.

면역세포를 포함한 동물실험 대체용 3차원 인공 피부 시스템의 개발 및 평가

조윤지 인하대학교 대학원 2021 국내석사

화장품 및 소재의 독성시험 관련 규제가 엄격해짐에 따라 동물실험의 대안으로 인공 피부를 활용하는 경우가 증가하고 있으며, 치료 혹은 연구의 목적으로 인공 피부 플랫폼을 사용하기도 한다. 이러한 이유로 인해 in vivo와 유사한 시스템을 개발하려는 노력들이 이루어지고 있다. 하지만 지금까지 개발된 인공 피부 시스템은 대부분 2차원 배양을 기반으로 하거나 면역세포가 포함되어 있지 않기 때문에, 보다 복잡하고 실제와 유사한 시스템 개발의 필요성이 증가하고 있는 추세이다. 본 연구에서는 면역세포를 포함한 3차원 인공 피부 배양 시스템을 개발하였다. 면역세포가 포함된 시스템과 대조군에 염증반응을 유도하여 면역 인자의 발현 양상을 비교하였으며, 2차원 배양과 3차원 배양 시스템을 비교하여 시스템의 타당성을 입증하였다. 또한, 염증반응 유도 여부에 따른 배지를 회수하여 matrix metalloproteinase의 발현량을 비교하였다. 추가적으로, 개발된 시스템에 건선을 유도함으로써 피부 질병 모델로의 활용 가능성에 대해 확인하였다. 건선을 유발하였을 때 건선 인자 발현량이 증가함을 확인하였고, H&E staining을 통해 histology를 확인하여 각질층의 두께가 증가함을 확인하였다. 개발된 인공 피부 시스템을 응용한다면 추후 두드러기, 아토피 피부염, 알레르기 모델 등 면역 세포와 관련 있는 피부 질병 모델로도 적용할 수 있을 것으로 보인다.

정장제용 Lactobacillus spp.의 Clostridium butyricum의 생장 증진과 중금속 제거 및 내산성에 관한 특성 연구

신유진 인하대학교 대학원 2021 국내박사

건강에 도움을 줄 수 있는 것으로 알려진 프로바이오틱스에 대한 연구들은 다양한 방면에서 지속적으로 연구되고 있으며, 소비자들의 건강에 대한 관심도의 증가는 프로바이오틱스 시장을 지속적으로 성장시키고 있다. 또한 최근 연구들을 통하여 장내 미생물 구성 및 미생물의 대사산물은 위장뿐 아니라 면역체계, 대사질환 및 정상적인 중추신경계 기능까지 전방위적으로 영향을 미친다는 것이 증명되고 있다. 이러한 연구 결과 및 시장의 확대로 잠재적 프로바이오틱스의 다양한 기능성에 관한 연구들이 요구되고 있다. 본 연구에서는 프로바이오틱스로써 가장 많이 사용되는 균 중 하나인 Lactobacillus 속 유산균들의 프로바이오틱스로서 다양한 기능성 연구를 수행하였으며, 보유하고 있는 건강한 한국 여성으로부터 분리한 83 균주의 유산균과 2008년부터 패류에서 분리해온 166 균주의 유산균을 대상으로 잠재적 프로바이오틱스인 Lactobacillus의 탐색 및 특성 연구를 수행하였다. 먼저 유산균에 의한 Clostridium butyricum의 생장 증진 효과에 대한 연구를 수행하였다. C. butyricum은 건강한 사람과 동물의 장 내에서 자주 발견되는 균으로 butyric acid를 생산하고, 장 내 형태를 개선하는 등 이로운 효과를 가지고 있으며, 일부 균주는 프로바이오틱스로서 안정성이 확인되었다. 본 연구에서는 생균수 확인과 qPCR을 이용하여 Lactobacillus parabuchneri MH44와 Lactobacillus brevis JL16에 의한 C. butyricum 생장 증진 효과를 확인하였으며, butyric acid를 생산에 관여하는 주요 유전자인 buk gene의 발현량 증가를 확인하였다. 두 Lactobacillus의 프로바이오틱스로서의 기본 특성을 확인하기 위하여 산과 담즙 내성, auto-aggregation, 동결건조 스트레스 내성 및 가속화 실험을 수행하였으며, 두 균주 모두 산에 대한 내성이 낮아 이에 대한 보완이 필요함을 확인하였다. 이후 유산균 전용 상업용 배지에서 L. parabuchneri MH44의 배양 (4 L)을 통해 상업화 가능성을 확인하였다. 두 번째로, 유산균의 산 내성과 관련된 연구를 수행하였다. 섭취 후 살아서 장까지 도달하여야 하는 프로바이오틱스는 기본적으로 위장 내에서 노출되는 스트레스, 특히 위의 극도로 낮은 pH에 대한 내성이 있어야 한다. 본 연구에서 발굴한 Lactobacillus johnsonii MH33, L. johnsonii MH21과 Lactobacillus gasseri KLB240은 프로바이오틱스에 있어 가장 큰 스트레스 요인인 산 저항성이 우수한 균주로 pH 2에서 3시간까지 초기 농도의 0.1%의 생존율을 확인하였다. SEM 분석을 통하여 산성 조건에서 세포 형태변화를 확인하였으며, L. gasseri KLB240만 pH 2에서 6시간 후 세포 표면의 손상을 확인하였다. 또한 산 저항성과 연관 있다고 알려진 atpD gene의 발현이 중성 조건 (pH 7.2)에서보다 산성 조건 (pH 2)에서 증가함을 RT-qPCR을 통하여 분석하였다. 더불어, 산 저항성을 높이는 대사경로에 필요한 기질인 arginine과 glutamate를 첨가하였을 때, L. gasseri KLB240의 산 저항성 (pH 2)이 증진되는 것을 확인하였다. 세 Lactobacillus의 프로바이오틱스로서 기본 특성을 확인하기 위하여 담즙 내성, auto-aggregation, 동결건조 스트레스 내성을 확인하였고, 가속화 실험을 통하여 L. johnsonii MH33과 L. gasseri KLB240가 각각 250일 이상 냉장 보관 가능할 것으로 예측하였다. 이 두 유산균 L. johnsonii MH33과 L. gasseri KLB240를 유산균 전용 상업용 배지에서 배양 (4 L)을 진행하였으나, L. gasseri KLB240만이 109 CFU/mL 규모로 배양되었다. 마지막으로, 유산균를 통한 중금속 제거 및 내성과 관련된 연구를 수행하였다. 중금속은 인체에 누적 시 배출이 어려워 적은 양에 대한 노출에도 잠재적인 위험성을 가지고 있다. 인체에 유해하다고 알려진 대표적인 중금속인 Pb, Cd, As, Cu에 대해 내성이 있는 유산균 7 균주의 중금속 제거능을 ICP-OES를 통하여 확인하였으며, 상대적으로 제거율이 낮았던 Cd, As에 대하여 균주의 농도를 높인 결과 균주 간의 제거율은 큰 차이가 없음을 확인하였다. 프로바이오틱스로서 유산균의 안전성에 문제가 될 수 있는 항생제 내성은 중금속 내성과 유전적 연관성이 있다고 알려져 있어 7 유산균의 항생제 내성을 확인하고 항생제 다재내성 지수가 0.32 이하로 확인된 3 균주 (L. fermentum KLB79, KLB100, KLB203)를 최종 선택하였다. 각 Lactobacillus가 갖는 프로바이오틱스로서 기본 특성 (산과 담즙 내성, Auto-aggregation, 동결건조 스트레스 내성)을 확인하였으며, L. fermentum KLB203이 가장 높은 결과를 나타냈으며, 이후 가속화 실험에서도 냉장보관 시 가장 긴 기간인 140일 정도 보관이 가능할 것으로 예측되었다. Probiotics has previously demonstrated the health promotion effects associated with the gastrointestinal tract, and the growing interest in health among consumers continues to grow the size of the probiotics market. Recent findings on microbes in the field have made it possible to expect more diverse effects from gut microbiota, and the expansion of the probiotics market is demanding studies of various functionalities for potential probiotics. We have continuously collected 83 Lactobacillus strains from healthy Korean women and 166 Lactobacillus strains from shellfish since 2008. The aim of this study was to examine the growth promotion effect of Clostridium butyricum, acid resistance and heavy metal removal effect as a potential probiotics of Lactobacillus. The intestinal microorganisms and their microbial metabolites are proving to affect almost every aspect of human health, not only the intestinal health but also immune system, metabolic diseases and normal central nervous system functions. C. butyricum is a bacterium often found in the intestines of healthy people and animals and has beneficial effects, such as producing butyric acid, improving intestinal form, and some strains have been confirmed to be safe as probiotics. The effects of improving C. butyricum growth of Lactobacillus parabuchneri MH44 and Lactobacillus brevis JL16 were confirmed by determining the cell number. Using qPCR the expression of buk gene, which is involved in the production of butyric acid was found to be enhanced by Lactobacillus. The characterization (acid and bile resistance, auto-aggregation, freeze-drying stress tolerance) of L. parabuchneri MH44 and L. brevis JL16 for essential probiotics confirmed that before being used as probiotics, acid resistance of each strain must be supplemented. The possibility of commercialization was examined accelerated storage experiment and fermentation (4L) of L. parabuchneri MH44. Probiotics that are supposed to reach the intestine should basically be resistant to stresses exposed during tranfer, especially extreme low pH. We found three strains, Lactobacillus johnsonii MH33, L. johnsonii MH21 and Lactobacillus gasseri KLB240 are highly acid resistant strains, with survival rates of more than 0.1% at initial concentrations from pH 2 to 3 hours. The SEM analysis identified cell shape changes in acid conditions and the expression of atpD gene known to be associated with acid resistance, increased in acidic condition (pH 2) than in neutral conditions (pH 7.2). Further, it was confirmed that acid resistance (pH 2) of L. gasseri KLB240 increased with arginine and glutamate, which are the necessary substrates for metabolic pathways that enhance acid resistance. To determine the essential properties of the two Lactobacillus as probiotics, acid and bile resistance, auto-aggregation, freeze-drying stress tolerance were examined. In the acceleration experiment after freeze-drying using skimmed milk, L. johnsonii MH33 and L. gasseri KLB240 were expected to be stored up to 8 months at 4℃, respectively. In the media for commercial probiotics production, L. gasseri KLB240 reached the stationary phase at above 109 CFU/mL after 9 hours, but L. johnsonii MH33 was not cultured with possible reasons such as inadequate culture conditions and media. Heavy metals are difficult to eliminate when accumulated in the human body, imposing health hazard even if exposed to small amounts. The removal capability of 7 lactic acid bacteria was confirmed through ICP-OES for Pb, Cd, As, and Cu, which are representative heavy metals harmful to the human body, and the tendency to increase the removal rate by increasing the concentration of strains for Cd and As, which had relatively low removal rates, was confirmed. Antibiotic resistance which could be a problem with the safety of probiotics is known to be genetically related to heavy metal resistance, therefore the antibiotic resistance of 7 Lactobacillus strains was examined and the final choice of 3 strains (L. fermentum KLB79, KLB100, KLB203) with less than 0.31 multidrug resistance index was made. To determine the essential properties of the three Lactobacillus as probiotics, KLB203 strain showed more desirable characteristics such as resistance to bile and auto-aggregation.In the acceleration experiment after freeze-drying using skimmed milk, L. fermentum KLB79, KLB100 and KLB203 were expected to be stored up to 22, 54 and 140 months at 4℃, respectively.

질병 진단 및 화학적 유해물질의 현장 검출을 위한 특이적 리셉터 및 고감도 바이오센서 개발

이민지 인하대학교 대학원 2022 국내석사

본 연구는 파지디스플레이 기법을 이용한 타겟 특이적인 리셉터를 발굴하고, 국소표면플라즈몬공명 (LSPR), 측방유동면역분석법 (LFIA)를 이용하여 질병 및 화학적 위해인자를 현장 검출할 수 있는 바이오센서 플랫폼을 제시한다. 바이오센서는 바이오리셉터 (bioreceptor)와 분석물질 (analyte) 간의 상호작용에 의해 생성되는 물리·화학적 신호를 측정하여 정성·정량 분석할 수 있는 장치나 소자를 의미한다. 최근 바이오센서 기술의 발전으로 복잡한 장비와 절차 없이 빠르고 간편하게 목적 물질을 검출할 수 있어 질병 진단, 식품, 환경 모니터링 등 광범위한 분야에서 현장 진단 센서로 활용되고 있다. 따라서 본 연구에서는 바이오센서를 구성하는 두 가지의 기본 요소인 바이오리셉터와 신호변환기 (transducer)를 이용하여 바이오센서를 제작하는 과정으로 이루어져 있다. 먼저, 제 1장에서는 항체 제작 기술로 각광받고 있는 파지디스플레이를 이용하여 PD-L1에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 발굴하는 연구를 소개하였다. 12개의 무작위한 서열을 가지는 M13 파지 라이브러리를 이용하여 PD-L1에 대해 바이오패닝을 수행하였으며, 바이오패닝 후 분리한 파지 클론에 대해 유전자 및 효소면역법 (ELISA)을 이용하여 PD-L1에 특이적인 펩타이드를 발굴하였다. 본 연구를 통해 발굴한 PD-L1 특이 펩타이드는 후속 연구를 통해 암의 예후를 진단하는 바이오센서의 리셉터로 활용될 수 있을 뿐만 아니라, PD-1/PD-L1 기작을 억제하여 면역 반응을 회복시키는 항 PD-L1 펩타이드로 활용할 수 있다. 제 2장에서는 LSPR과 LFIA 기반의 바이오센서를 제작하여 동물용의약품 중 하나인 락토파민을 검출하는 연구를 소개하였다. 구체적으로, LSPR 센서는 유리 기판에 15 nm의 금 나노입자를 링커 (linker)로써 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES)를 이용하여 균일하게 증착시켰으며, 그 위에 락토파민 항체를 결합시킴으로써 락토파민 검출 LSPR 센서를 제작하였다. 또한, LFIA 스트립은 경쟁적 반응 (competitive assay)을 기반으로 하여 제작되었다. 제작한 두 종류 센서의 성능과 현장 적용 가능성을 확인하기 위해 실제 식품 시료에 락토파민을 첨가(spiking)하여 검출하는 연구를 수행하였으며, 결과적으로, LSPR 센서는 0.3 fg/mL, LFIA 스트립은 2.27 ng/mL까지 락토파민을 선택적으로 검출할 수 있었다. 또한, LSPR 센서는 약 30분 이내, LFIA는 10 분 이내로 검출이 가능하기 때문에 상기 결과들을 기반으로 1차적인 식품 안전 모니터링 방법으로, 혹은 더 나아가 질병의 조기 진단을 위한 센서 제작으로 응용될 수 있다. In this study, we present to discover target-specific receptors using phage display techniques and develop biosensor platforms based on local surface plasmon resonance (LSPR) and lateral flow immunoassay (LFIA) that can be used for on-site detection of disease and chemical hazard. A biosensor is a device that can detect physical and chemical signals qualitatively and quantitatively, generated by the interaction between the analytes (DNA, RNA, virus, chemical, cells, etc.) and target-specific bioreceptors (antibody, aptamer, enzyme, etc.). Recently, With the increasing development of the nano-biosensor techniques, biosensor has been broadly applied in the point-of-care detection to diseases, agriculture, food, and environmental monitoring because of its advantages such as simple, rapid, user-friendly, miniaturization, and low-cost. Therefore, in this study, we have dealt with research methods for development of biosensors using two basic elements that consist of biosensor, a bioreceptor and transducers. The first study is a phage display technique to discover peptides specifically bind to programmed cell death ligand 1 (PD-L1) which is a biomarker of tumor cell. The PD-L1 is directly immobilized to streptavidin-coated microwell plate and conducted biopanning process using an M13 phage library that is displayed random 12-mer amino acid sequences at the N-terminus of pⅢ coat protein of M13 phage. And a PD-L1 specific peptide was selected by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). This peptide can not only be used as bioreceptor for detection of cancer cell, but also as anti-PD-L1 receptor, which blocks PD-L1 to restore immune response. Secondly, we have developed LSPR and LFIA biosensor for on-site detection of ractopamine, one of the veterinary drugs, in food samples. Specifically, gold nanoparticles (AuNPs) were uniformly deposited on a transparent substrate via a 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) as linker to obtain a LSPR chip and the anti-ractopamine antibody as a receptor was functionalized on the surface of gold nanoparticles. In addition, the LFIA strip was developed based on a competitive assay. To evaluate the fabricated LSPR and LFIA sensor, sensitivity and quantitative analysis experiments were conducted on. Under optimized rection condition, the developed sensors were able to detect as little as 0.3 fg/mL (LSPR) and 2.27 ng/mL (LFIA) of ractopamine spiked pork samples selectively. In addition, these sensors can be detected rapidly within about 30 minutes using LSPR sensor and within 10 minutes using the LFIA sensor. As a result, the sophisticated biosensor techniques including screening of bioreceptor and choosing proper transducer such as LSPR and LFIA to analyte are essential to the development of on-site detection sensor.

Development of Gene Amplification-Based Expression System for High-Production Recombinant Proteins in Animal Cell

고영훈 인하대학교 대학원 2024 국내석사

Animal cell culture technology is a technique used for the production of therapeutic proteins, antibodies, and pharmaceuticals. Currently, there is a continuous increase in demand for recombinant protein therapeutics produced in mammalian cell in the biopharmaceutical market. Among these, Chinese hamster ovary (CHO) cells are widely utilized as the primary cell for commercial production of therapeutic proteins. CHO cell offer the advantage of being capable of suspension culture, making them suitable for large-scale production of recombinant proteins. Additionally, the technology for efficient gene amplification systems and high-expression cell line selection is well-established in CHO cell. While using animal cells for expression systems has various advantages, it also has the drawback of lower productivity compared to microbial systems. Furthermore, the development of techniques for large-scale protein production in cells has traditionally been based on information from the cell's genome, transcriptome, proteome, and metabolome. Particularly, at the genomic level, the technology for amplifying target genes, which can be considered as the starting point for protein production, has traditionally involved codon deoptimization of the host cell and the use of selection markers with high selective pressure. To meet the high demand for biopharmaceuticals, it is essential to quickly obtain high-productivity cells with low levels of selective pressure in a short time. However, the existing gene amplification systems, such as PEST codon deoptimization and selection marker genes, suffer from the challenge of requiring high selective pressure and an extended duration to enhance productivity. In addition, if the production period is prolonged, the stability of the cell genome can decrease, potentially impacting the productivity of the target protein. Therefore, in this research, efforts were made to establish a new amplification system for the production of target proteins in cell. As a result, the degron sequences, when compared to known gene amplification systems, were found to have a high degradation capacity and relatively short sequences, reducing the likelihood of causing structural issues with the target protein. These degron sequences were fused to selection marker genes, which were used to produce the target protein. Cell transfection was employed for the generation and selection of cells that produce the target protein through electroporation. This approach aimed to establish efficient expression vectors for high-productivity cell line development. Among various Degron sequences, including UbR, UbK, and UbS, which exhibit different levels of degradation strength, we fused each of them to the upstream region of the nutritional marker gene DHFR. This fusion was carried out to co-express these Degron sequences with the target protein, human transforming growth factor-beta Ⅰ (hTGF-β1). To facilitate this co-expression, the IRESatt sequence was inserted between the expression cassette for hTGF-β1 and the expression cassette for DHFR. Using the engineered marker, we selected the cell line with the highest expression as determined by ELISA among the transfected cell lines, and then proceeded with a clone selection process through limiting dilution. This study provides insights into the development of high-productivity cell lines and the selection process, including the use of degron sequences fused to upper selection marker genes for gene amplification mechanisms and production analysis through recombinant vectors and transfected cell. 동물세포배양기술은 치료용 단백질이나 항체 및 의약품의 생산들에 쓰이는 기술이다. 현재 바이오 의약품 시장에서 포유류 세포에서 생산되는 재조합 단백질 치료제에 대한 수요가 지속적으로 증가하고 있다. 그 중 Chinese hamster ovary (CHO) 세포가 치료용 단백질의 상업적인 생산을 위한 주요 세포로 이용되고 CHO 세포는 부유배양이 가능해 재조합 단백질의 대량 생산에 용이하며, 효율적인 유전자 증폭시스템과 고 발현 세포주 선별에 대한 기술이 잘 밝혀져 있다는 장점이 있기 때문이다. 세포주 개발에는 CHOpro3-로부터 DHFR 유전자가 모두 결손 된 CHO-DG44 (DHFR-/-) 세포주가 일반적 으로 널리 사용되고 대신 되고 있는데 이러한 동물세포를 이용한 발현시스템에는 여러 가지 장점이 있지만 미생물에 비해 생산성이 낮다는 단점도 있다. 또한 세포에서 목적 단백질을 대량으로 생산하는 기술 개발은 세포 내 유전체, 전사체, 단백체, 대사체의 정 보를 기반으로 이루어져 왔다. 특히, 단백질 생산의 시작이라 할 수 있는 유전체 수준에 서 목적유전자의 증폭 기술은 분해서열과 선별마커유전자의 코돈 비최적화가 전통적으 로 사용되고 있다. 최근 바이오 의약품에 대한 높은 수요에 대응하기 위해서는 낮은 농 도의 선택압으로 단기간에 고생산능 세포를 확보하는 것이 중요하다. 그러나 기존에 사 용하는 유전자증폭시스템인 PEST 분해서열과 선별마커 유전자의 코돈 탈최적화는 생산 성을 높이는데 높은 농도의 선택압과 오랜 시간이 걸린다는 문제점을 가지고 있다. 그 리고 제작기간이 오래 걸리면 세포 유전체의 안정성이 감소하여 목적단백질의 생산성에 영향을 끼칠 수 있다. 이에, 본 연구에서는 세포에서 목적단백질 생산을 위한 새로운 증 폭 시스템을 구축하고자 노력한 결과, 분해서열 Degron은 기존에 알려진 유전자증폭시 스템과 비교하여 분해능이 높고 비교적 짧은 서열을 가지고 있어 목적단백질의 구조적 인 문제를 야기할 가능성이 낮아 Degron 서열을 선택 마커 유전자에 융합하였다. 세포 형질감염은 목적단백질을 생산하는 세포를 전기침공법으로 생성 후 선별하는데 사용함 으로써, 고생산능 세포주 개발을 통해 세포주개발 기술을 구축하고 세포주 개발에 있어 서 효율적인 발현벡터를 사용하여 고생산능 세포주를 얻는 과정을 확립하고자 하였다. Degron의 여러 서열 중에서 분해강도가 상, 중, 하의 세기를 갖는 UbR, UbK, UbS를 각 각 영양요구성마커 유전자 DHFR의 상위에 융합하여 목적단백질로 생산하는 인간전환성 장인자(hTGF-β1)와 함께 발현하기 위해 IRESatt를 hTGF-β1 발현 카세트와 DHFR 발현 카세트 사이에 삽입하였다. 융합된 마커를 통해 형질감염한 세포주 중 가장 높게 발현 되는 마커를 선택하였고 제한희석을 통해 Clone 선별과정을 진행하였다. 본 연구는 분 해서열 Degron을 영양요구성마커 유전자의 상위에 융합하여 유전자 증폭기작을 통해 목적 단백질의 생산성을 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질감염된 세포 를 통한 생산량 분석을 통해 고생산성 세포주 개발 및 선별과정을 제공한다.

실크 피브로인과 카라기난을 기반으로 한 온도 및 광 반응성 3D 바이오 잉크 개발

문서형 인하대학교 대학원 2022 국내석사

3D 바이오프린팅 기술은 개인 맞춤형 인공장기 실현화의 높은 가능성을 제시한다. 현재까지 활용되고 있는 바이오잉크의 재료로, 금속과 세라믹은 우수한 가공성과 강한 기계적 물성을 가지므로 의족, 의안, 의치와 같은 보철물 제작에 이용되었고, 합성 고분자는 연조직 대체 소재로 사용되어왔다. 그러나 유기 용매에 녹여 고온에서 출력이 가능하기 때문에 손상된 조직에 직접 출력하여 동시에 이식이 가능한 시스템 확립에 한계를 가진다. 이러한 의미에서, 낮은 점도와 느린 젤화 속도, 기계적 물성 부족과 관련된 몇 가지 문제를 극복한다면, 생체 환경과 비슷한 조건에서 출력이 가능하며 생체적합성이 우수한 소재인 단백질 또는 다당류 기반의 바이오잉크 개발이 이러한 문제를 해결할 것으로 기대된다. 본 연구에서는 아이오타-카라지난과 실크 피브로인을 기반으로한 바이오잉크를 개발하였다. 카라지난의 특성으로는 10분 안에 열 반응성 젤화가 진행되어 잉크의 점성을 높인다. 피브로인의 베타 시트 구조 및 광가교성 다이타이로신 결합에 의하여 3차원 구조체의 기계적 물성을 향상시켜 구조체의 안정성을 제공한다. 본 바이오잉크는 압출과 동시에 무너지지 않고 50층 이상의 적층성을 보인다. 더나아가 높은 해상도로 다양한 신체 기관 유사 구조체를 출력가능하다. 특히 본 바이오잉크로 출력된 구조체의 조직강성도는 피부, 방광, 각막 세포의 조직강성도와 상응하는 약 250kPa 수준에 미친다. 결론적으로 본 바이오잉크는 생체내 분해 속도, 표적 기관에 따른 조직 강성도, 물리적 성질 등 목적에 맞는 다양한 세포지지체를 출력할 수 있으므로, 다양한 재생 의학에서 응용될 수 있음을 기대한다.

연속 바이오의약품 바이러스 여과 공정에서 단백질과 바이러스 간의 경쟁적 확산에 의한 영향

이주은 인하대학교 대학원 2025 국내석사

Purification process development for host cell protein clearance and high purity of Fc-fusion ADAM

임정애 인하대학교 대학원 2024 국내박사

Optimizing CRISPR-mediated gene activation system in Chinese hamster ovary cells

유현욱 인하대학교 대학원 2024 국내석사

배경: Chinese hamster ovary (CHO) 세포는 바이오 의약품 산업에 서 선호되는 세포주이다. 그에 따라 수많은 연구자들이 CHO 세포의 성 능을 향상시키기 위한 노력을 기울이고 있으며, 이를 위한 주요 전략 중 하나가 생장 및 생산성과 관련된 유전자의 발현이다. CRISPR 활성화 (CRISPRa) 시스템은 유전자 스크리닝 시스템 중 하나이다. 이 시스템 을 통해 가이드 RNA (gRNA)를 변경함으로써 간단하고 빠르게 여러 유전자의 발현이 가능하다. 선행 연구에서는 이 시스템이 다양한 유형의 인간과 마우스 세포주에서 효과적임을 입증하였지만, CHO 세포에서는 체계적인 연구가 부족하였다. 따라서, 이 연구에서는 CHO 세포에 유용 한 유전자들을 탐색하는데 도움을 주기 위하여 CRISPRa 시스템이 CHO세포에서도 잘 활용될 수 있도록 최적화하였다. 결과: CRISPRa의 효과는 여러가지 요인에 따라 달라진다. 따라서, 이 요인들을 조절하기 위하여 형광 발현 유전자를 CRISPRa 시스템을 활용해 활성화했고, CHO세포에서 형광 발현 정도가 최대가 되는 조건을 최적 조건으로 판단하였다. 그리고 찾아낸 최적의 조건을 적용하여 CHO 세포의 내인성 유전자를 활성화하였다. 결과적으로, 해당 유전자의 전사량이 크게 증가한 것을 확인할 수 있었다. 또한, CRISPRa에 의한 유전자 활성화 효과는 강력한 유전자 발현 효과로 알려져 있는 형질 전 환 유전자 발현 방법과 비교했을 때 충분히 효과적이었다. 또한, CRISPRa에 의한 유전자 활성화 효과는 강력한 유전자 발현 효과로 알 려져 있는 형질 전환 유전자 발현 방법과 비교했을 때 충분히 효과적이 었다. 결론: 본 연구에서는 CRISPRa 시스템의 효과에 영향을 미치는 여러 가지 요인들을 조절하여 CHO cell에서 최적의 효과를 낼 수 있는 조건 을 찾았다. 실제로 이 조건을 사용하였을 때, 내인성 유전자가 잘 활성 화되었음을 확인할 수 있었다. 따라서, CRISPRa가 유전자 스크리닝 도 구로서 잘 활용될 수 있음을 보여줄 수 있었다. 나아가, 본 연구에서 찾 아낸 최적화된 CRISPRa의 조건은 앞으로 CHO세포에서 이 방법을 사 용하여 cell engineering에 유용한 유전자들을 쉽고 빠르게 찾아내는데 도움이 될 것이라고 생각한다. Background: Chinese hamster ovary (CHO) cells are the preferred cell lines in the biopharmaceutical industry. Thus, many researchers have made efforts to improve the performance of CHO cells. One of the primary strategies for this is the expression of genes related to their growth and productivity, and through gene screening, these useful genes can be identified. The CRISPR activation (CRISPRa) system is one of gene screening tool. This system allows for the easy and rapid expression of multiple genes, by simply altering the guide RNA (gRNA). While previous studies have demonstrated its effectiveness in various types of human and mouse cell lines, it has not been widely studied in CHO cells. Therefore, the purpose of this study is optimizing CRISPRa system for CHO cell to facilitate the screening of genes useful for improving CHO cell performance. Results: The effectiveness of CRISPRa depends on several factors. Therefore, by controlling these factors, this study activated the fluorescent gene using the CRISPRa system and determined the optimal conditions that maximally activate the expression of fluorescence in CHO cells. The optimal conditions found were applied to the activation of the endogenous gene in CHO cells. As a result, the transcription level of the target gene was successfully increased. Also, the gene activation effect of CRISPRa was sufficiently effective when compared to the effect of transgene expression, which is known for its strong gene expression effect. Conclusion: In this study, the optimal conditions for CRISPRa system in CHO cells were identified by controlling various factors that influence its effectiveness. When the identified conditions were applied, successful activation of endogenous genes was confirmed. Therefore, this result demonstrated the possibility of CRISPRa as an effective gene screening tool. Furthermore, the optimized CRISPRa conditions identified in this research will be helpful in quickly and easily searching useful genes for CHO cell engineering in the future.

Chinese hamster ovary 세포 배양에서 미토콘드리아 생합성 유도를 통한 재조합 단백질 생산성 증대

강혜임 인하대학교 대학원 2022 국내석사

Chinese hamster ovary (CHO) 세포는 large-scale에서 부유배양 및 유전적 조작이 쉬우며 사람과 유사한 번역 후 변형 (post-translational modification; PTM)을 가지는 등 바이오 의약품 생산에 적합한 다양한 특성 및 장점을 가지고 있어, 바이오의약품 산업에서 가장 많이 사용되는 숙주세포 (host cell)이다. 하지만 Escherichia coli (E.coli)와 같은 원핵세포 단백질 발현 시스템에 비하여 생산성이 낮다는 단점을 가지고 있어 현재까지 CHO 세포에서 생산성을 높이기 위한 다양한 연구들이 계속되고 있다. CHO 세포가 동화작용을 통하여 재조합 단백질을 생산하기 위해서는 많은 양의 에너지를 필요로 한다. 이러한 에너지를 생산하며 세포 내 다양한 기능을 수행하는 미토콘드리아는 tricarboxylic acid (TCA cycle)과 산화적 인산화 (oxidative phosphorylation; OXPHOS) 과정을 통해 세포 내 에너지 산물인 adenosine triphosphate (ATP)를 생산하는데 가장 주된 역할을 하는 세포소기관이다. 미토콘드리아 생합성 (mitochondrial biogenesis)은 세포가 미토콘드리아 수를 증가시키는 과정으로 생물학적으로는 칼로리 제한, 유산소 운동 등 다양한 신호에 의해 활성화된다. CHO 세포의 생산성을 향상시키기 위한 연구로 TCA cycle 등 미토콘드리아로의 에너지 대사를 증가시키려는 선행연구는 존재하지만 미토콘드리아 수 자체를 증가시키는 연구는 보고된 바 없다. 본 연구에서는 CHO 세포에서 이러한 세포의 에너지 발전소인 미토콘드리아의 생합성을 유도하여 에너지 생산을 늘리고 그에 따라 생산성이 향상되는지 보고자 하였다. 이를 위해 배양 프로세스에 관점을 두어 미토콘드리아 생합성을 유도한다고 알려진 nicotinamide adenine dinucleotide (NAD)와 resveratrol이라는 두 가지 화학 첨가물을 이용하여 미토콘드리아 생합성을 유도하였다. 숙주 세포주와 생산하는 항체의 종류가 다른 세 가지 세포주 (Cell line A, B and C)를 이용하여 8 mM의 NAD와 50 μM의 resveratrol을 배양 3일차에 첨가하여 회분 배양 (batch culture)으로 진행하였다. 그 결과 NAD를 첨가해준 조건에서 세 세포주 모두 대조군 대비 최종 항체 생산량 (titer) 및 specific productivity (qp)가 증가하였고 (titer (cell line A: 1.54배, cell line B: 1.40배, cell line C: 1.98배), qp (cell line A: 1.85배, cell line B: 1.36배, cell line C: 1.60배)) resveratrol를 첨가해준 조건에서는 cell line A, B에서 titer는 대조군과 유사하였지만 qp가 각각 약 1.41배, 1.11배 증가하였다. 다음으로 세포의 에너지 생산의 증대를 확인하기 위하여 ATP level assay를 진행한 결과, 미토콘드리아 생합성 유도물질을 첨가한 조건에서 세 세포주 모두 ATP level이 대조군 대비 증가하였다. 또한 미토콘드리아 생합성이 유도되었는지 확인하기 위해 quantitative polymerase chain reaction (qPCR)을 진행한 결과, 세 세포주 모두 대조군 대비 미토콘드리아 생합성 관련 유전자 및 에너지 대사 관련 messenger RNA (mRNA) 발현량이 증가하였고 미토콘드리아 DNA (mitochondrial DNA; mtDNA) 또한 증가했음을 확인하였다. 결론적으로, 미토콘드리아 생합성 유도물질을 이용하여 CHO 세포에서 미토콘드리아 생합성을 유도한 결과, 세포주에 따라 각 물질에 대한 생리활성 효과는 다른 경향을 보이는 경우도 존재하였지만 미토콘드리아 생합성이 세포의 에너지 생산을 향상시키고 그로 인하여 생산성에 긍정적인 영향을 미칠 수 있다는 것을 확인하였다.