오프라인과 비교한 온라인 컨셉테스트의 타당성검증

현인경 숭실대학교 2021 국내석사

The objective of this study is to assess the validity of online concept test. In this study, the effect visual display on the concept board by survey method on the purchase intention and understanding score was investigated A 2x2 between subject experiment was conducted in which two independent variables were the insertion of visual display and survey media, and two dependent variables were purchase intention score and understanding scores. 100 university student living in Seoul participated in this experiment. Concept test were replicated first on the product, and then on the service. The insertion of visual display was found to have no significant effect on purchase intention regardless of whether it is product or service. on The other hand, the insertion of visual display was found to have significant effect on the understanding score when concept test was done on the service. Generally, the effect of insertion of visual display was not moderated by survey media. Therefore, we don’t have to use different format between online and offline concept test. 본 연구에서는 신제품개발 시 소비자조사의 일종인 컨셉테스트(concept test)에서 온라인 조사 방법과 오프라인 조사 방법을 비교하여 온라인 컨셉테스트의 신뢰도와 타당성 검증하는데 목적이 있다. 본 연구에서의 신제품개발 시 출시 전 소비자 조사의 일종인 컨셉테스트에서 삽화(visual)의 제시 여부가 구매의향과 이해도에 미치는 영향을 survey 유형(오프라인 조사와 온라인 조사)별로 알아보았다. 본 연구를 위해 2x2 집단간 요인 설계의 실험을 진행하였다. 독립변수는 삽화의 제시 여부이고 조절 변수는 survey 유형을 사용하였다. 종속변수는 구매의향과 이해도를 사용하였다. 실험을 위해 서울 지역 대학교에 재학 중인 학생을 대상으로 삽화의 제시 여부를 2가지로 조작하여 보여준 후 구매의향과 이해도를 측정하였다. 구매의향 측면에서 제품과 서비스 삽화 제시 여부는 오프라인 조사와 온라인 조사에서 모두 차이가 없는 것으로 나타났다. 시간과 비용을 고려하여 온라인 조사를 하는데 여기서는 삽화를 제시하지 않아도 된다는 것을 의미한다. 이해도 측면에서 제품과 서비스 간에 차이가 나타났다. 특히 서비스 컨셉테스트를 하는 경우에 삽화 제시가 차별성에서 높게 평가되었다. 따라서 본 연구 결과는 오프라인 조사 방식을 그대로 온라인에서 시행해도 차이가 없다는 점을 의미하기 때문에 기업들이 시행하는 온라인 조사에 의한 컨셉테스트 타당성을 뒷받침해 준다.

Inhibition of Pseudomonas psychrophila and Serratia quinivorans by their bacteriophages in chicken meat 

김민곤 중앙대학교 대학원 2019 국내석사

가금육의 생산과 소비가 증가함에 따라 가금육의 미생물학적 안전성이 중요해졌다. 식품산업에 있어 미생물에 의한 가금육의 부패는 상품의 질을 떨어뜨려 경제적 손실을 일으킨다. 가금육은 도살이나 포장 과정 중 미생물에 의해 주로 오염된다. 일반적으로 미생물에 의한 육제품의 부패방지는 냉장보관을 통해 미생물의 생장을 억제함으로써 이뤄진다. 그러나 내냉성 미생물의 경우 냉장온도에서도 생장하여 육제품의 부패를 일으킨다. 내냉성 미생물 중 Serratia와 Pseudomonas는 생고기에서 가장 많이 발견되는 균주로 이들 균주에 의한 부패 또한 이전 연구를 통해 보고되었다. 이와 같은 부패성 미생물을 억제하기 위해 유기산, bacteriocin, 화학물질 등이 주로 이용되고 있으나 비교적 낮은 억제능력과 부작용으로 인해 새로운 억제 방법이 필요하다. 따라서, 이번 연구에서는 새로운 생물제제(Biocontrol agent)인 bacteriophage를 부패성 미생물을 억제하는데 이용했다. Serratia quinivorans CB1과 Pseudomonas psychrophila B2 두 균주를 냉장 닭 가슴살로부터 분리하였다. 분리된 균주의 단백질 분해능력과 내냉성 특성을 확인하였으며, 각각의 균주를 숙주로 하는 SLP1과 PP1 bacteriophage 또한 냉장 닭 가슴살로부터 분리하였다. 닭 가슴살로부터 분리된 bacteriophage의 형태학적 특성을 투과 전자현미경을 통해 확인한 결과 SLP1과 PP1 모두 Caudovirales 목의 Siphoviridae 과에 속하는 것으로 나타났다. 또한, 두 bacteriophage 모두 pH의 경우 3 ~ 12 조건에서, 온도의 경우 4°C ~ 37°C 조건에서 안정한 것으로 나타났다. 용균활성(lytic activity)의 경우 10°C 조건에서 SLP1과 PP1 모두 닭 가슴살보다 TSB에서 더 높은 활성을 보였다. SLP1과 PP1은 TSB에서 숙주세균의 수를 각각 4.15, 4.68 log CFU ml-1 만큼 감소시켰으며, 닭 가슴살의 경우, 각각 3.48, 2.83 log CFU g-1 만큼 감소시켰다. 또한, 두 bacteriophage 모두 보관실험이 종료되는 5일차 샘플에서 109 PFU ml-1 정도의 titer가 확인되어, 냉장조건의 닭 가슴살에서도 안정한 것으로 확인되었다. 이는 SLP1과 PP1 bacteriophage가 닭 가슴살 내에서 Serratia quinivorans CB1과 Pseudomonas psychrophila B2를 억제할 수 있는 생물제제로 이용될 수 있음을 나타낸다. Microbial safety of poultry meat is become important as consumption and production of poultry meat was increased. In the food industry, spoilage of poultry meat by microorganisms can cause economic losses by lowering the quality of products. Poultry meats usually contaminated by spoilage microorganisms during the slaughtering or packaging process. In general, spoilage of poultry meat by microorganisms was suppressed under the chilled condition. But some psychrotrophic bacteria can grow under refrigerated temperature and cause spoilage of meat. Among these psychrotrophic bacteria Serratia spp. and Pseudomonas spp. were frequently detected in raw chicken meat. To control such spoilage bacteria, organic acids, bacteriocin, and chemicals were commonly used. But, in this study we focused on bacteriophages that regarded as novel biocontrol agent and employ them to control bacteria. In this study, Serratia quinivorans CB1 and Pseudomonas psychrophila B2 was isolated from refrigerated chicken breast meat and their proteolytic and psychrotrophic characteristics were assessed. And bacteriophages SLP1 and PP1 targeting CB1 and B2 as their host, respectively, were isolated from chicken breast meat. Morphological characteristics of isolated bacteriophages were confirmed by transmission electron microscope. SLP1 and PP1 was belongs to family Siphoviridae of the order Caudovirales. Both bacteriophages were stable under different pH values (3 to 12) and temperatures (4°C to 37°C). Lytic activity of SLP1 and PP1 was evaluated in TSB and chicken breast meat. In liquid medium, two bacteriophages were shown higher lytic activity than chicken breast meat. The bacterial counts of CB1 was decreased by SLP1 up to 4.15 log reduction and B2 was decreased by PP1 up to 4.68 log reduction in TSB incubated at 10°C. In chicken breast meat, SLP1 suppressed CB1 bacterial loads up to 3.48 log reduction and PP1 suppressed B2 up to 2.83 log reduction during the storage at 10°C. Stability of SLP1 and PP1 in chicken breast meat was also proven after 5 days storage at 10°C. The results suggest that SLP1 and PP1 bacteriophages could be used to inhibit the growth of psychrotrophic bacteria in chicken meat during the storage at refrigerated condition.

Overexpression and characterization of the L-lactate dehydrogenases from Lactobacillus casei HY2782 to control post-acidification

이주은 중앙대학교 대학원 2019 국내석사

후산발효란 발효식품에 접종한 젖산균이 발효가 완료된 이후, 저장과정 중에 지속적으로 젖산을 생성하는 현상을 말하며, 이러한 현상은 발효유제품에서 빈번하게 발생한다. 하지만 후산발효는 강한 신맛, 유청 분리현상의 증가, 제품 내 유산균 수의 감소, 유통기한의 감소와 같은 부정적인 효과를 야기한다. 젖산 탈수소효소(LDH)는 젖산 발효 과정의 주요 효소 중 하나라고 할 수 있다. 따라서 LDH의 억제를 통한 후산 발효 억제가 가능할 것으로 생각된다. 해당 연구에서는 Lactobacillus casei HY2782 균주의 유전체 서열 분석(whole genome sequencing)을 통해 총 4개의 L-LDH 유전자(ldhL1, ldhL2, ldhL3 그리고 ldhL4)를 확인하였다. 각 유전자는 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 통해 증폭하였고, 발현 벡터인 pET–22b (+)에 삽입되어 E. coli BL21 (DE3)에 의해 성공적으로 발현되었다. 생산된 4종의 재조합 L-LDH는 Ni2+–NTA agarose를 이용하여 정제하였고 각각의 특성화를 진행하였다. 정제된 L-LDH들은 sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis (SDS–PAGE) 상에서 30–37 kDa의 분자량을 보였다. L-LDH3는 이들 중 가장 높은 활성을 보였으며, 25℃, pH 7.0에서 5 mM의 fructose 1,6–diphosphate (FDP)와 함께 3,990.42 U/mg의 specific activity를 나타냈다. L-LDH3는 43℃, pH 4.0 조건에서 8 mM의 FDP를 함께 처리하였을 때 최적의 활성(302,343.16 U/mg)을 보였다. 효소활성은 pH 5.0–7.0 범위에서 80% 이상을 유지하였으며, pH 4.0과 8.0에서 45%를 유지하였다. 또한 50℃ 이상에서 10분 방치하였을 때 효소 활성이 급격히 감소하였다. 산성 조건에서 L-LDH3는 2 mM의 Mg2+, Ca2+, Mn2+ 이온에 의해 활성이 증가하였고, Zn2+과 Cu2+ 이온에 의해 억제되었다. 또한 KH2PO4의 농도가 증가함에 따라 L-LDH3의 활성이 점차 감소하였다. 결과적으로 L. casei HY2782가 가지는 4개의 L-LDH 중 L-LDH3가 주요 효소로 생각되며, 이 효소는 해당 균주의 젖산 발효 과정에 있어 중요한 역할을 할 것으로 보인다. 따라서 Zn2+, Cu2+ 이온, KH2PO4 첨가에 의한 L-LDH3 활성의 억제는 L. casei HY2782에 의해 발생하는 후산 발효를 약화시킬 수 있는 한 가지 방법이 될 수 있을 것이라 생각된다. Post–acidification is common phenomenon occurred in fermented milk, in which lactic acid bacteria used as starter cultures continue the lactic acid fermentation during storage. However, this phenomenon can cause adverse effects on products, such as strong acidic taste, higher syneresis, decrease in bacterial counts and shelf–life reduction. Lactate dehydrogenase (LDH) is a key enzyme for lactic acid fermentation. Therefore, the control of LDH could be one of solutions to prevent post–acidification. In the present study, four L-LDH genes (ldhL1, ldhL2, ldhL3, and ldhL4) were identified by whole genome sequencing of the Lactobacillus casei HY2782. Each gene was amplified using polymerase chain reaction (PCR), inserted in expression vector, pET–22b (+), transformed into Escherichia coli BL21 (DE3), and expressed by IPTG induction. Four recombinant L-LDHs were then purified using Ni2+–NTA agarose column and characterized. The molecular weight of purified L-LDHs were 30-37 kDa on sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis (SDS–PAGE). Among the four L-LDHs, L-LDH3 exhibited highest enzyme activity. The specific activity was 3,990.42 U/mg at 25℃ and pH 7.0 with 5 mM fructose 1,6–diphosphate (FDP). The L-LDH3 exhibited maximal activity at 43℃ and pH 4.0 with 8 mM FDP by 302,343.16 U/mg. The enzyme retained more than 80% of its activity after incubation at pH 5.0–7.0 and 45% of the activity was retained at pH 4.0 and pH 8.0. After incubation at 50℃ for 10 min, the enzyme activity rapidly decreased. In acidic condition, L-LDH3 was activated by 2 mM of Mg2+, Ca2+ and Mn2+ ions, inhibited by Zn2+ and Cu2+ ions. In addition, activity of L-LDH3 was gradually decreased as KH2PO4 concentration increased. Consequently, the L-LDH3 seems to be major enzyme among the L-LDHs of L. casei HY2782 and may play an important role in lactic acid fermentation of this strain. Therefore, the inhibition of L-LDH3 activity using Zn2+, Cu2+ and KH2PO4 could be one of solutions to mitigate the post-acidification caused by L. casei HY2782.

THE SATISFACTION OF RETAILERS TOWARD VINASOY CORP

황밍브엉 숭실대학교 대학원 2019 국내석사

Isolation of psychrotrophic bacteria from raw milk and characterization of heat-resistant proteases from Pseudomonas rhodesiae F21 

권미래 중앙대학교 대학원 2019 국내석사

이 연구에서는 원유에 존재하는 미생물을 분리하고 저장 온도에 따른 미생물의 생장 특성을 확인하였다. 그리고 원유의 부패를 유발할 수 있는 단백질 분해 효소 활성을 가진 균들을 확인하고, 그 중 Pseudomonas rhodesiae F21균주를 선발하여 해당 균주가 생산하는 proteases의 특성을 분석하였다. 중앙대학교 농장에서 착유 된 신선한 원유에 존재하는 미생물을 알아보기 위해 총 세균수와 내냉성 세균수를 PCA배지를 사용하여 배양하였다. 이 후 단백질 분해능력을 가진 균주를 분리하기 위해 탈지분유가 첨가된 SMA를 사용하였다. 총 8회 시료를 채취하였으며, 전체 실험의 평균 총 세균수는 약 4 log, 내냉성 균은 약 3 log로 확인되었다. 다음 실험으로 1차, 2차 착유한 원유를 냉장 온도에서 보관 시 균수의 변화를 측정하였다. 두 실험 군 모두 4°C와 10°C에서 저장하였을 때 3일만에 약 8 log까지 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 특히 2차 원유는 1차 채취된 원유보다 초기 균 수가 1 log 정도 더 많았는데, 이는 tank에 저장되어 있던 1차 원유의 균이 증식한 것으로 생각된다. 이 결과는 원유에 존재하는 내냉성 균들이 냉장 보관하는 동안 증식하여 품질과 관련된 문제를 유발할 수 있다는 것을 의미한다. 앞의 실험을 통해 배지의 우유 성분을 분해하여 clear zone이 크고 선명하게 형성된 균주를 분리, 동정하였다. 총 11개의 균을 분리하였고, 그 중 Pseudomonas spp., Chryseobacterium spp.와 같은 부패성 균도 확인되었다. 이 결과는 원유에 단백질 분해 능력이 있는 균들이 존재할 때, 원유의 품질이 떨어지고 최종 제품에서도 문제를 유발할 가능성이 있다는 것을 보여준다. P. rhodesiae F21이 생산하는 proteases의 특성을 확인하기 위해 ammonium sulfate precipitation을 이용하여 부분정제 (40-60%) 하였다. 최적 조건을 확인하기 위한 실험 결과, 효소의 최적 온도는 45°C이며, 최적 pH는 6.5로 확인되었다. 또한, 4°C에서의 단백질 분해 활성은 48시간이 지났을 때 casein을 완전히 분해할 수 있었다. 신선한 원유의 pH는 보통 6.5-6.7이고, 냉장 보관을 하더라도 효소가 활성을 보일 수 있기 때문에 원유나 유제품의 casein을 분해하여 제품의 품질을 저하시킬 수 있다. 마지막으로 효소의 내열성을 확인한 결과, 65°C에서 20분 간 열처리를 진행하여도 최적 조건과 비교하였을 때 70% 이상의 활성을 보였다. 이는 일반적인 LTLT 살균 (63-65°C에서 30분 동안 가열)후에도 활성을 유지할 수 있다는 것을 의미하며, 이는 유제품의 부패를 유발하여 악취, 층 분리 등의 문제를 유발할 수 있다. 정리하자면, 원유는 미생물이 생장하기에 이상적인 조성을 가지고 있으며, 다양한 균이 존재한다. 그 중에는 낮은 온도에서도 생장이 가능한 내냉성 세균도 포함되어 있으며, 이러한 내냉성 균주 중 일부가 생성하는 단백질 분해 효소는 내열성을 가지고, 저온에서도 활성을 보이기 때문에 원유 및 유제품의 품질을 저하시키는 문제를 일으킬 수 있다. 하지만 해당 효소들의 비활성화는 현재의 제조과정에서 쉽지 않기 때문에 원유의 미생물 오염을 최소화하고, 원유는 미생물의 생장을 억제할 수 있는 추가적인 연구를 수행해야 할 것이다. In this study, microorganisms were isolated from raw milk and the growth characteristics of microorganisms were confirmed by storage temperature. And we identified the bacteria with proteolytic activity that cause spoilage the raw milk. Among them, we selected Pseudomonas rhodesiae F21 and analyzed the characteristics of the proteases produced by this strain. The number of total bacteria and number of psychrotrophic bacteria were cultured using plate count agar to investigate the microorganisms present in fresh raw milk from Chung-Ang University farm. Skim milk agar was used to isolate strains with proteolytic activity. A total of 7 samples was collected. The average of bacterial counts in whole experiments was about 4 log CFU/ml and the average of psychrotrophic bacterial counts was about 3 log CFU/ml. In the next experiment, changes in the number of bacteria were measured during storage at the refrigeration temperature using milk samples after milking and stored in the tank. In both groups, it was observed to increase to about 8 log CFU/ml in 3 days when stored at 4°C and 10°C. Especially, the secondary sample was 1 log more than first sample, which is thought to be grown during storage in the tank. This result implied that psychrotrophic bacteria present in raw milk may multiply during refrigeration and cause quality related problems. In the previous experiment, we isolated and identified bacteria that break down the milk component of the medium and make large and distinct clear zone. A total of 11 isolates were isolated, including microorganisms related to spoilage such as Pseudomonas spp., Chryseobacterium spp. These results showed that when there were bacteria with proteolytic activity in raw milk, the quality of raw milk is decreased and there is a possibility of causing problems in the final products. Growth characteristics of P. rhodesiae F21 belonging to the genus Pseudomonas, which is generally known to be a psychrotrophic food poisoning bacterium, were confirmed. It was able to grow well at 30°C/24 hours and 10°C/3 days in tryptic soy broth. Also, in the 5% skim milk, it increased to 106 CFU/ml for 2 days and to 107 CFU/ml for 6 days at 10°C. On the 7th day, it was confirmed that the color of skim milk changed transparently. It was considered that the casein was degraded by the growth of bacteria. As a result, it was confirmed that P. rhodesiae F21 could grow well at refrigeration temperature and could degrade casein of milk and cause quality deterioration. To characterize the proteases produced by P. rhodesiae F21, partial purification was performed using ammonium sulfate precipitation (40-60%). The optimal temperature of the proteases was 45°C and the optimal pH was 6.5. In addition, proteolytic activity at 4°C was able to completely decompose casein after 48 hours. Since the enzyme may be active even in refrigerated storage, it may degrade the quality of the product by decomposing the casein of milk or dairy products. Finally, the heat resistance of the proteases was examined. As a result, the proteases showed an activity of 70% or more as compared with the optimal condition even after heat treatment at 65°C for 20 minutes. This means that it can remain even after the LTLT pasteurization (63-65°C for 30 minutes), which can lead to deterioration of dairy products and can lead to problems such as odor and sedimentation.

Isolation of characterization of Lactobacillus plantarum CLP3, a potential probiotic strain with cholesterol-lowering effects

한래희 중앙대학교 대학원 2020 국내석사

프로바이오틱스는 살아있는 미생물로 숙주의 장내 미생물 균형을 유지시키거나 향상시켜 숙주의 건강을 증진시킨다. 유산균에 의한 콜레스테롤 저하 효과가 그 중 하나다. 프로바이오틱스의 콜레스테롤 저하 기작에는 세표 표면으로의 콜레스테롤 흡수, 세포 막으로의 콜레스테롤 동화, bile salt hydrolase (BSH)를 통한 bile acid의 deconjugation 이 있다. 이 중 가장 각광받고 있는 것은 프로바이오틱스가 생산하는 BSH에 의한 콜레스테롤 감소다. 간의 콜레스테롤은 conjugated bile acid를 합성하기 위해 사용된다. 이 conjugated bile acid는 소장으로 분비되는데 장 내 BSH 활성 균이 있다면 conjugated bile acid를 deconjugation 시켜 deconjugated bile acid를 생산한다. Decounjugated 된 bile acid는 solubility 가 감소해 그대로 분으로 배출되며, 새로운 conjugated bile acid 합성을 유도하고 결과적으로 콜레스테롤이 감소하게 된다. 본 연구에서는 BSH 활성을 가진 균주가 장관 순환을 중단시킴으로써 콜레스테롤 저하 효과를 보일 것이라 가정하고 BSH positive 균주를 스크리닝 하였다. 김치에서 BSH positive 균주 Lactobacillus plantarum CLP3 를 분리하였으며 이 균주의 프로바이오틱스 특성과 콜레스테롤 저하 효과를 in vitro 와 in vivo에서 확인하였다. CLP3는 pH 3과 담즙산 0.5% 에 2시간 노출 되었을 때, 각각 57.46% 와 43.46% 의 생존율을 보였다. 이를 통해 CLP3는 내산성과 내담즙성을 가지고 있음을 확인하였다. In vitro에서 CLP3는 88.97% 의 콜레스테롤 저하 효과를 보였다. In vivo에서는 CLP3를 고 콜레스테롤 사료로 고콜레스테롤 혈증(hypercholesterolemia)이 유도된 C57BL/6J mice 에게 4 주간 경구투여한 후 콜레스테롤 저하 효과를 확인하였다. CLP3 투여 그룹은 그렇지 않은 그룹보다 혈중 콜레스테롤, 중성 지방, LDL 콜레스테롤이 낮았다. 반면에 HDL 콜레스테롤은 높았고 LDL-C/HDL-C 비율도 개선시켰다. CLP3는 FXR 을 downregulation 시키고 CYP7A1 과 CYP8B1을 upregulation 시켜 콜레스테롤을 담즙산으로 전환하여 콜레스테롤 소모를 촉진했다. 또한, CLP3 는 LXRα 와 PPARα 의 agonist 로 작용하여 β-oxidation 과 콜레스테롤 배출을 촉진하여 혈중 콜레스테롤과 중성지방을 감소시켰다. 이는 CLP3 가 콜레스테롤 수치 저하에 도움을 주며 간에서 CYP7A1 발현을 조절함으로써 고콜레스테롤 혈증을 개선하는 생균제 후보가 될 수 있음을 나타낸다. Probiotics are defined as live microorganisms when administered in adequate amounts, improve the general health of the host. Cholesterol lowering effect by lactic acid bacteria (LAB) is one of the proposed probiotic activities. Bile salt hydrolase (BSH) activities of LAB are directly correlated with bile salt and lipid metabolism. The hypothesis of this research is a strain having BSH activity would have a cholesterol lowering effect based on the interruption of enterohepatic circulation (EHC) in the body. In this study, BSH positive bacterium, Lactobacillus plantarum CLP3 was isolated from kimchi and its probiotic and cholesterol lowering potentials were examined. After 2 h exposure to pH 3.0, L. plantarum CLP3 survived with the survival ratio of 57.46%. L. plantarum CLP3 also survived 43.46% after 2 h exposure to 0.5% bile salts. In vitro cholesterol lowering activity was evaluated by o-phthaladehyde (OPA) method. The L. plantarum CLP3 showed the high cholesterol lowering capacity (88.97%). The present study investigated the hypocholesterolemic effects of L. plantarum CLP3 in C57BL/6J mice fed a high cholesterol diet. Assessment of the in vivo cholesterol lowering property of L. plantarum CLP3 showed that the levels of serum total cholesterol, triglycerides, and low-density lipoprotein cholesterol and high-density lipoprotein cholesterol (LDL-C/HDL-C) ratio decreased significantly (p < 0.05). To explore their cholesterol-lowering mechanisms of action, the expression levels of the genes on the cholesterol metabolic pathways were determined. Expression of the low-density lipoprotein receptor (LDLR) were marginally affected by the feeding of L. plantarum CLP3; however, the gene expression of LXRα, ABCG5/8, CYP7A1, and CYP8B1 were upregulated (p < 0.01) and FXR, NPC1L1 were significantly downregulated (p < 0.001). Taken together, these characteristics suggest that L. plantarum CLP3 could be a potential probiotic candidate for the development of cholesterol lowering probiotics and reduce the risk of cardiovascular diseases.

Application of bacteriocin-producing lactic acid bacteria and bacteriophage in fresh cheese for efficient control of Listeria monocytogenes

윤성희 중앙대학교 대학원 2020 국내석사

식중독균에 대한 생물학적 제어는 제품의 안전성을 향상하고 유통기한을 늘리기 위해서 식품 분야에서 해결해야 할 하나의 과제이다. Listeria monocytogenes는 listeriosis를 일으키는 식중독균으로 넓은 범위의 조건에서 살아남을 수 있어 관리가 쉽지 않으며, 특히 치즈와 같이 조리를 거치지 않는 식품에서 발견된다. 이 논문에서는 항균 활성이 있는 유산균을 분리하고 치즈 스타터로 적용하여 L. monocytogenes의 억제에 효과가 있는지 평가하고, 니신과 박테리오파지를 혼합하여 사용하였을 때 L. monocytogenes 억제에 더 효과적인지 확인하였다. 원유에서 항균 활성을 갖는 Lactococcus lactis 균이 분리 및 확인되었다. 분리된 균 CAU2013은 산 생성 능력이 낮아 부가 스타터로 더 적합하다. 음식에 적용할 수 있는지 확인을 위하여 Listeria에 대한 억제 능력을 우유 배지에서 배양하며 확인하였다. 탈지유 배지에서는 6시간 이후 L. monocytogenes가 검출되지 않았으며, 시유에서는 9시간 이후 1 log unit 감소하였다. 상업적 스타터인 TCC-3를 주 스타터로, L. lactis CAU2013은 부가 스타터로 사용하여 신선 치즈를 제조하였다. L. monocytogenes (5 log CFU/g)를 치즈 제조 중 접종하였으며 5일간 4℃와 10℃에서 보관하며 생균 수를 측정하였다. 치즈 제조 중 스타터는 9 log CFU/g까지 자랐으며 L. monocytogenes는 저장 기간 중 1 log unit 감소하였다. 박테리오신과 박테리오파지의 상승효과는 4℃와 10℃에서 5일간 보관하며 확인하였다. 슬라이스 치즈에 L. monocytogenes (6 log CFU/g)가 접종되었으며, 니신 2 IU/㎕와 박테리오파지가 MOI 1, 10, 100의 농도로 처리되었다. 니신과 박테리오신을 함께 처리하였을 때 L. monocytogenes가 3에서 6 log unit 감소하였으며 가장 효과적이었다. 결과적으로 박테리오신 생성 유산균을 스타터로 사용하였을 때 L. monocytogenes의 억제에 효과적이었으므로 Lactococcus lactis CAU2013은 치즈의 기능성 부가 스타터로 적용할 수 있을 것이다. 또한, 박테리오신과 박테리오파지를 함께 사용하였을 때 L. monocytogenes에 대한 억제 효과가 증가하였다. 따라서 박테리오신과 박테리오파지를 함께 사용하였을 때 더 효율적으로 상품의 안전성 및 유통기한을 증진할 수 있을 것이다. In the recent years, biocontrol of foodborne pathogens has been one of the concerns in the food industry, particularly in the dairy industry, due to safety issues. Listeria monocytogenes is one of the foodborne pathogens that usually causes listeriosis. The biggest problem is a great viability since it can survive in a wide range of environments that are hard to control, especially ready-to-eat products, such as milk, cheese, sausage, and smoked fish. To improve the safety of the product and extend shelf life, it is essential to control L. monocytogenes. The purpose of this study is to isolate lactic acid bacteria with antimicrobial activity, evaluate its applicability as a cheese starter, and evaluate the inhibitory effects on Listeria monocytogenes. Furthermore, the study aims to determine the synergistic effect of combining nisin with bacteriophage in controlling L. monocytogenes. From raw milk, Lactococcus lactis strain with antibacterial activity was isolated and identified. The strain CAU2013 was a low acidifier making it a suitable candidate as an adjunct starter culture. The anti-listerial activity of strain CAU2013 was determined in milk broths at 30℃ to confirm its potential application in the food matrix. L. monocytogenes was not detected after 6 h incubation in skim milk broth whereas, 1 log unit decrease was observed after 9 h incubation in whole milk. The laboratory-scale fresh cheese was produced using the commercial starter culture TCC-3 as primary starter culture and L. lactis CAU2013 as an adjunct starter culture. L. monocytogenes (5 log CFU/g) was inoculated during cheese production and monitored during the storage at 4℃ and 10℃ for 5 days. The starter cultures reached to 9 log CFU/g during production, while L. monocytogenes decreased by 1 log unit during a storage. The synergistic effect of bacteriocin and Listeria phages was determined in cheese during the storage at 4℃ and 10℃ for 5 days. L. monocytogenes (6 log CFU/g) was inoculated on the sliced cheese and treated with 2 IU/㎕ nisin and varying concentration of bacteriophage (MOI 1, 10, 100). The treatment of nisin and bacteriophage was most efficient, reducing 3 to 6 log units of L. monocytogenes. The use of the bacteriocin-producing LAB as a starter culture resulted in an efficient inhibition of L. monocytogenes. Therefore, Lactococcus lactis CAU2013 can be used as a protective adjunct starter culture for a cheese production. Additionally, a synergistic effect was observed when combined bacteriocin and bacteriophage were used. This suggests that the combined use of bacteriocin and bacteriophage is more efficient in controlling L. monocytogenes during production and storage conditions and can improve the safety of the product leading to an increase of its shelf-life.

Prevalence and characteristics of methicillin-resistant and -susceptible Staphylococcus aureus isolated from pig farms and slaughterhouses

이수인 중앙대학교 대학원 2022 국내석사

Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) is a significant human pathogen in healthcare systems and community settings. In recent years, MRSA associated with livestock had reported in various farm animals worldwide. Livestock-associated MRSA and MSSA (LA-MRSA and LA-MSSA) have frequently been reported as a potential source for human infections. MRSA and MSSA in livestock can be transmitted to the farm environment, farm workers, and foods of animal origin. Clonal complex 398 (CC398) is the most frequent clone of LA-MRSA in Korean pig industry. Recently, the risk of LA-MRSA in public health has increased as the human infections caused LA-MRSA CC398 have been reported. Multidrug resistance (MDR) by antimicrobial exposure is a serious threat of public health. Because of the emergence of multidrug resistant MRSA and MSSA isolated from livestock animals, the risk of zoonotic transmission of multidrug resistant MRSA and MSSA has been emerging. Although MSSA CC398 has been also isolated from pig-associated facility, the studies of LA-MSSA in livestock are still limited worldwide. As MSSA CC398 has recently become a frequent source of human infections, being involved in serious infectious diseases, the potential risk of LA-MSSA has been increasing. In this investigation, we assessed i) prevalence of MRSA and MSSA in pig farms and slaughterhouses including pigs, carcasses, facility environment, and workers; ii) antimicrobial resistance phenotypes of MRSA and MSSA isolates; iii) genotypes [multilocus sequence typing (MLST), spa, staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec), agr] and virulence genes (lukF, lukS, tst, eta and etb) of the MRSA and MSSA isolates. The prevalence of MRSA in pigs, farm environment, and farm workers were 23.4% (n = 75), 7.3% (n = 7) and 7.4% (n = 2), respectively. In addition, 89 MSSA strains were isolated from pigs (n = 74, 23.1%), farm environment (n = 9, 9.4%), and workers (n = 6, 22.2%). Four MRSA and 15 MSSA strains were also isolated from slaughterhouse samples. The majority of MRSA and MSSA isolates from pig farms were clonal complex 398 (CC398). The most prevalent genotype (MLST-spa-SCCmec) of MRSA in pig was ST541-t2876-IX (n = 25) followed by ST398-t18102-V (n = 22) and ST398-t571-V (n = 20). Almost all MRSA CC398 and MSSA CC398 isolates exhibited multidrug resistance (MDR) phenotype. In conclusion, these results suggest that co-selection pressure associated with various antimicrobial usage in pig farms in Korea may have caused high prevalence of LA-MRSA CC398 and LA-MSSA CC398 with high MDR phenotype. 메티실린 내성 황색포도상구균은 병원 및 지역사회에서 사람에 질병을 일으키는 중요한 병원성 세균이다. 최근 이러한 MRSA는 다양한 가축에서 발견되고 있고 특히 돼지에서의 분리율이 증가하고 있다. 가축 유래 MRSA는 농가 내 환경과 종사자로 전달되며, 양돈 산업 종사자에서 또한 LA-MRSA가 보고되고 있다. Clonal complex 398(CC398)은 미국, 유럽, 한국 등의 국가에서 가축 산업, 특히 양돈 산업에서 가장 빈번하게 보고되는 가축 유래 MRSA 유전형 중 하나로 우리나라에서도 보고된 바 있다. 최근 사람 질병의 원인균으로서 LA-MRSA CC398이 보고되고 있으며 이에 따라 공중 보건에 위협이 되고 있다. LA-MRSA CC398의 경우 가축 생산을 위한 항생제 사용의 환경적인 특성 때문에 베타-락탐계 항생제뿐만 아니라 다양한 계열의 항생제에 대한 내성을 가지고 있으며, 내성균이 지역 사회에 퍼질 경우 심각한 항생제 내성 문제를 야기한다. MRSA와 더불어 MSSA 또한 양돈 산업에서 빈번하게 분리되며 사람에게서 질병을 일으킴에도 불구하고 LA-MSSA에 관한 논문은 아직 제한적이다. 따라서 본 연구에서는 양돈 농가와 도축장의 돼지, 도체, 환경, 종사자에서 MRSA와 MSSA 분리율, 분리주의 분자 유전학적 특징, 항생제 내성률을 분석하고 평가했다. 돼지, 농가 환경, 종사자에서의 MRSA 분리율은 각각 23.4% (n = 75), 7.3% (n = 7), 7.4% (n = 2)였다. MRSA와 더불어 89주의 MSSA가 돼지 (n = 74, 23.1%), 농가 환경 (n = 9, 9.4%), 종사자(n = 6, 22.2%)에서 분리되었다. 도축장에서는 4주의 MRSA와 15주의 MSSA가 분리되었다. 양돈 농가와 도축장에서 분리된 대부분의 MRSA와 MSSA 분리주가 CC398에 속했으며, 가장 많은 유전형은 ST541-t2876-IX (n = 25)이었고 다음으로 ST398-t18102-V (n = 22), ST398-t571-V (n = 20)이었다. MSSA 한 주를 제외한 모든 MRSA CC398과 MSSA CC398는 세 가지 이상의 계열에 내성을 가지는 다제내성균이었다. 결론적으로 다양한 항생제를 사용하는 한국의 양돈 산업에서 높은 내성률을 가지는 CC398이 지배적으로 분리되었으며 MRSA뿐만 아니라 MSSA 분리주도 높은 내성률을 가지는 것을 확인했다.

Differences in susceptibility to antimicrobial peptides affect host adaptation of methicillin-resistant staphylococcus aureus

김선도 중앙대학교 대학원 2022 국내석사

Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) is crucial pathogen in both humans and animals. Previous studies had confirmed that specific genotypes of MRSA are predominantly isolated by hospitals, communities, and farm animals. In Korea, previous investigation identified that ST5 and ST72 MRSA strains were major genotypes in hospitals and communities, respectively. In addition, ST398 and ST541 were significant genotypes in pig production systems, and ST692 and ST188 were the major genotypes in chickens or chicken carcasses in Korea. The host innate immunity including host defense peptides (HDPs), especially cathelicidins would affect the host adaptation of MRSA. This study compared differences in susceptibility of MRSA mainly isolated from various hosts in Korea to HDPs, and measured surface positive charge, carotenoid pigment, and protease activity, which were known as resistance mechanism of MRSA against HDPs. The antimicrobial activities of the HDPs were confirmed in the order of CATH-2 (from chickens), PMAP-36 (from pigs), and LL-37 (from humans), and MRSA adapted to the host showed enhanced the level of resistance to the HDPs of same host. The surface charge was relatively high in ST5, ST692, and ST188 strains which enhanced the levels of resistance to LL-37 and CATH-2. Also, ST5 and ST188 produced more carotenoid pigments than those of other strains. However, protease activity was highest in ST541 and lowest in ST5 strains, which was proportional result of resistance level of PMAP-36. In conclusion, these results suggested that the differences susceptibility to HDPs affects in the host adaptation ability of MRSA. In addition, the increased surface positive charge and carotenoid pigments production enhanced the levels of resistance to LL-37 and CATH-2, and the extracellular protease activity were related to PMAP-36 resistance of MRSA. 메티실린 내성 황색포도상구균 (MRSA)은 동물과 사람 모두에 치명적인 병원균이다. 선행 연구에서 병원과 지역사회, 농장 동물에 따라 특이적인 유전형의 MRSA가 주로 분리되고 있음을 확인했다. ST5와 ST72 MRSA는 각각 한국의 병원과 지역사회에서 주요 유전형이었다. 추가적으로, ST398과 ST541 MRSA는 양돈 환경에서의 중요한 유전형이었으며 ST692와 ST188은 양계와 닭고기에서 주요 유전형이었다. 숙주 방어 펩타이드 (HDPs), 특히 카텔리시딘을 포함하는 숙주의 선천적 면역체계는 MRSA의 숙주 적응에 영향을 줄 수 있다. 본 연구는 한국의 각 숙주에서 주로 분리되는 MRSA가 HDPs에 대한 감수성 차이를 조사하였으며 HDPs에 대한 MRSA의 저항기작인 표면 양전하와 카로티노이드 색소, 프로테아제 활성을 측정하였다. HDPs의 항균 활성은 닭 유래 CATH-2, 돼지 유래 PMAP-36, 사람 유래 LL-37 순서로 확인했으며 숙주에 적응한 MRSA는 동일한 숙주의 HDPs에 대한 저항 정도가 증가한 것으로 나타났다. 표면 양전하는 ST5와 ST692, ST188이 비교적 높았고 이는 LL-37과 CATH-2에 대한 저항성을 증가시켰다. 또한, ST5와 ST188은 카로티노이드 색소 생산이 다른 균주들에 비하여 많았다. 그러나, 프로테아제 활성은 ST541이 가장 높았으며 ST5가 가장 낮았는데, 이것은 PMAP-36에 대한 저항 정도와 비례하는 결과였다. 결론적으로, 이러한 결과들은 HDPs에 대한 감수성 차이가 MRSA의 숙주 적응 능력에 영향을 주고 있음을 시사한다. 또한, 표면 양전하의 증가와 카로티노이드 색소 생산은 LL-37과 CATH-2에, 세포 외 프로테아제 활성은 PMAP-36에 대하여 MRSA의 HDPs 저항성과 관련되어 있음으로 추론한다.

Comparative characteristics of hospital-associated and community-associated methicillin-resistant staphylococcus aureus isolates : antimicrobial resistance, antimicrobial peptide resistance, Biofitness, and Murein Hydrolase activity

박지헌 중앙대학교 대학원 2022 국내석사

Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) is an important zoonotic pathogen in the health care system, community, and livestock environment throughout the worldwide, and is receiving great attention due to an antibiotic resistance problem. MRSA can be classified into hospital-associated MRSA (HA-MRSA), community-associated MRSA (CA-MRSA), and livestock-associated MRSA (LA-MRSA) depending on the environment it is isolated. In Korea, the major genotypes of HA-MRSA and CA-MRSA are sequence type 5 MRSA carrying SCCmec type II (ST5-MRSA-II) and ST72-MRSA-IV, respectively. Although previous studies have generally focused on epidemiology, virulence genes, and antimicrobial resistance of MRSA strains isolated from hospital- or community-associated environment, there have been limited studies comparing the factors causing differences in virulence and prevalence of HA- and CA-MRSA. Therefore, in this study, ST5-MRSA-II and ST72-MRSA-IV strains were subjected to comparative analyses of 1) genetic characteristics, 2) antimicrobial resistance and host defense cationic antimicrobial peptide resistance, 3) biofitness, and 4) murein hydrolase activity. Although all of ST5-MRSA-II and ST72-MRSA-IV strains were resistant to an antimicrobial class of β-lactams, ST5-MRSA-II strains exhibited higher levels of multidrug resistant versus the ST72-MRSA-IV. Biofitness analyses revealed that ST5-MRSA-II strains grew relatively slower, had higher autolysis activity, and higher biofilm formation activity than those of ST72-MRSA-IV strains. The enhanced growth rates of ST72-MRSA-IV strains were also confirmed in competition growth cultures. In light microscopy analysis, ST72-MRSA-IV strains showed larger aggregates relative to ST5-MRSA-II strains, indicating lower levels of murein hydrolase activity in ST72-MRSA-IV strains. The lower levels of murein hydrolase activities in ST72-MRSA-IV strains were also demonstrated in zymographic analyses. When were the two groups of MRSA strains exposed to oxacillin based on each stain’s MIC, ST72-MRSA-IV strains still maintained higher levels of growth rates versus the ST5-MRSA-II strains, indicating enhanced biofitness of ST72-MRSA-IV strains in the presence oxacillin. In addition, both group showed resistance to LL-37 than CATH-2, especially, ST5-MRSA-II showed relatively higher resistance versus ST72-MRSA-IV. Based on these results, it is likely that the enhanced growth rate and growth yield exhibited by ST72-MRSA-IV strains are associated with the high prevalence of this genotype in community environment, where antibiotic use is relatively limited compared to healthcare facilities. In contrast, higher level of antimicrobial resistance and carriage of major toxin genes may contribute to the high prevalence of ST5-MRSA-II in healthcare environment. These novel findings provide an important insight regarding the prevalence and clinical consequences of different clonal lineages in MRSA infections in community and healthcare environments. 메티실린 내성 황색포도상구균(MRSA)은 전 세계적으로 의료기관, 지역사회 및 가축에서 중요한 인수공통 병원균의 하나로, 최근 항생제 내성 문제로 인해 큰 주목을 받고 있다. MRSA는 분리 환경에 따라 병원 유래 MRSA (HA-MRSA), 지역사회 유래 MRSA(CA-MRSA)및 가축 관련 MRSA(LA-MRSA)로 분류할 수 있다. 국내에서 HA-MRSA 및 CA-MRSA의 주요 유전자형은 각각 ST5-MRRSA-II 및 ST72-MRSA-IV이다. 이전 선행연구는 일반적으로 병원 또는 지역사회 관련 환경에서 각각 분리된 MRSA 균주의 역학, 병원성 및 항균제 내성에 중점을 두었지만 HA 및 CA-MRSA의 병원성 및 유병률의 차이를 일으키는 요인을 동시에 비교〮분석하는 연구는 매우 제한적으로 수행되었다. 따라서 본 연구에서는 ST5-MRSA-II 및 ST72-MRSA-IV 균주들의 비교분석을 위하여 1) 유전적 특성, 2) 항균제 내성 및 숙주 유래 양이온성 항균 펩타이드 내성, 3) 생체 적합성, 4) 뮤레인 가수분해효소에 대한 비교 분석을 실시하였다. 모든 ST5-MRSA-II 및 ST72-MRSA-IV 균주가 β-lactam 항생제에 대해 내성을 나타내었지만, ST5-MRSA-II 균주에서 ST72-MRSA-IV에 비해 더 높은 수준의 β-lactam 내성과 다약제 내성이 확인되었다. Biofitness 분석은 ST5-MRSA-II 균주가 ST72-MRSA-IV 균주보다 상대적으로 느리게 성장하고 자가분해 활성이 더 높았으며 생물막 형성 활성이 더 높은 것으로 나타났다. ST72-MRSA-IV 균주의 향상된 성장률은 경쟁 성장 배양에서도 확인되었다. 광학현미경 분석에서 ST72-MRSA-IV 균주는 ST5-MRSA-II 균주에 비해 더 큰 응집체를 보였으며, ST72-MRSA-IV 균주에서 낮은 수준의 murein hydrolase 활성을 확인했다. ST72-MRSA-IV 균주에서 낮은 수준의 murein hydrolase 활성도는 zymographic 분석을 통해서도 입증되었다. 두 그룹의 MRSA 균주가 각 균주별로 실시한 옥사실린의 최소 억제 농도에 노출되었을 때, ST72-MRSA-IV 균주는 여전히 ST5-MRSA-II 균주에 비해 더 높은 수준의 성장률을 유지했으며, 옥사실린에 유무에 따라 ST72-MRSA-IV 균주의 생체 적합성이 향상되었음을 알 수 있었다. 또한 항균 펩타이드의 숙주 유래의 따라 다른 결과를 보였다. 두 그룹 다 사람 유래 항균 펩타이드인 LL-37에 대해 높은 저항성을 보였으며, 특히 ST5-MRSA-II에 저항성이 더 높았다. 이러한 결과를 바탕으로 볼 때 ST72-MRSA-IV 균주가 나타내는 향상된 성장률 및 높은 수준의 항균 펩타이드 내성은 의료 환경에 비해 항생제 사용이 상대적으로 제한된 지역사회 환경에서 이 유전자형의 높은 유병률과 관련이 있을 가능성이 있다. 이러한 새로운 발견은 지역사회 및 의료 환경에서 MRSA 감염의 유병률 및 임상 결과에 관한 중요한 통찰력을 제공한다.