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- 저자 : 사공민근 (검색결과 3 건)
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국내 H9N2 조류인플루엔자 바이러스에 대한 실시간 유전자 진단방법 및 백신 개발
H9N2 조류 인플루엔자는 1990년대 이후 전 세계적으로 발병하여 가금류 산업에 막대한 경제적 손실을 초래해왔다. 많은 국가의 경우에서 저병원성 H9N2 조류 인플루엔자의 오랜 역사를 고려할 때, H9N2 조류 인플루엔자는 한번 유입되면 고병원성 조류 인플루엔자보다 더 근절이 어렵다. 국내에서는 지난 20여 년간 백신 접종과 적극적인 국가 예찰 등 방역 전략과 다양한 예방 조치를 통해 Y439 계통의 H9N2 조류 인플루엔자를 성공적으로 통제해왔다. 하지만, 2020년 6월에 발생한 새로운 Y280 계통의 H9N2 조류 인플루엔자는 이후 전국적으로 급격히 확산되어 새로운 문제로 대두되었다. 이 연구에서는 국내 H9N2 조류 인플루엔자의 발생 역사, 유전적 및 병원성 특성, 방역 전략을 검토하고, 이를 바탕으로 현재 국내 저병원성 H9N2 조류 인플루엔자를 적절히 통제하기 위한 전략과 기술로써 H9N2에 대한 고감도의 실시간 유전자 진단기법과 백신 개발을 수행하고 그 결과를 제시한다. 2000년대 이후 국내 가금류에서는 Y439 계통의 H9N2 조류 인플루엔자가 유행했으며, 현재는 Y280 계통이 새롭게 유입되어 전국적으로 유행하고 있다. 바이러스의 확산과 순환을 막기 위해서는 먼저 적극적인 예찰 프로그램을 통한 신속한 진단이 매우 중요하다. 그러나 현재 국내 조류 인플루엔자 국가 예찰 체계는 고병원성 바이러스를 검출하기 위해 바이러스의 M, H5, H7 유전자만을 목표로 하는 실시간 유전자 진단법을 사용하고 있으며, 저병원성 조류 인플루엔자의 경우 진단과 아형 확인을 위한 시험 등으로 검사 시간이 오래 걸리고 다량의 시료에 대해서는 검사 효율이 낮은 상황이다. 따라서 본 연구에서는 현재 국내에서 여러 계통의 H9 조류 인플루엔자 바이러스가 공존할 수 있는 상황에서 광범위하게 바이러스를 검출할 수 있는 새로운 H9N2 조류 인플루엔자 바이러스 실시간 유전자 진단법을 개발하여 다수의 임상 검체를 적용하여 평가했다. 새롭게 개발한 Uni Kor-H9 분석법은 국내 가금류와 야생조류에서 유래한 Y439 계통뿐만 아니라 현재 유행하는 Y280 계통의 바이러스에 대해서도 높은 민감도를 보였으며, 다른 아형의 조류 인플루엔자 바이러스 및 다른 조류 병원체와의 교차 반응 없이 검출할 수 있었다. 또한, Uni Kor-H9 분석법은 국외에서 발표된 다른 H9 조류 인플루엔자 바이러스 실시간 유전자 진단법과의 비교 평가에서도 국내에서 분리된 바이러스들에 대해 가장 높은 민감도와 검출률을 나타냈다. 결론적으로, 높은 민감도와 특이도로 국내에서 유행하는 H9 조류 인플루엔자 바이러스를 검출할 수 있는 Uni Kor-H9 분석법은 기존의 진단 방법인 바이러스 분리와 역전사 중합효소연쇄반응법보다 신속하고 효율적인 진단이 가능하며, 국내 조류 인플루엔자 예찰과 능동 감시에 적용한다면 신속하고 효율적인 바이러스 진단을 통해서 보다 효율적으로 바이러스를 통제하고 관리할 수 있는 기반을 제공하는 데 도움이 될 것으로 기대된다. 본 연구에서는 기존 국내 Y439 계통 H9N2 바이러스에 대한 백신주보다 최근 발생 및 유행 바이러스에 더 적합한 새로운 백신 후보를 선정하고, 종란에서 여러 차례 접종하여 전체 불활화 백신(vac564)으로 사용할 수 있는 백신 후보주를 제작했다. 목적 동물인 닭을 대상으로 동물실험을 통해 면역원성 및 방어 효능을 평가했으며, 그 결과, 불활화 백신(vac564)은 종란에서 높은 수율로 생산할 수 있고 닭에서 높은 면역원성을 나타냈다. 이 백신은 접종 동물의 맹장 편도에서 바이러스를 100% 억제하는 것으로 확인되었으며, 상동 바이러스를 접종한 후 인·후두 또는 총배설강에서 바이러스 배출이 전혀 발견되지 않았다. 그러나 이 백신은 Y280 계통의 이종 바이러스에 대해서는 충분히 효과적인 보호를 유도하지 못했다. 그리고 수입된 상업용 G1 계통 백신의 경우에는 주요 조직에서 Y280 및 Y439 계통 바이러스에 대한 바이러스 복제를 일부 억제했지만, 두 계통의 바이러스에 노출된 후 인·후두 및 총배설강에서 접종 후 최대 5일까지 바이러스가 배출되는 것으로 확인되었다. 종합하면 새로운 불활화 백신(vac564)은 한 번 접종으로도 높은 수준의 면역 반응을 유도할 수 있으며, Y439 계통 H9N2 바이러스로부터 닭을 효과적으로 보호할 수 있음을 보여준다. 하지만, 다른 계열의 H9N2 조류 인플루엔자 바이러스에 대해서는 효과가 제한적으로 확인되었으며, 이러한 결과는 다양한 계통의 H9N2 바이러스에 대해서 넓은 방어 효능을 가지는 새로운 백신에 관한 후속 연구와 준비의 필요성을 시사한다.
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돼지생식기호흡기증후군(porcine reproductive and respiratory syndrome; PRRS)은 현재 국내뿐만 아니라 전 세계적으로 양돈 산업에 가장 큰 경제적 손실을 입히고 있는 질병중의 하나이다. PRRS는 전 연령대의 돼지에게서 호흡기 질환을 유발하고 모돈의 유, 사산을 증가시켜 양돈 농가의 생산성에 막대한 영향을 미치고 있다. 이 질병을 매개하는 돼지생식기호흡기증후군 바이러스(porcine reproductive and respiratory syndrome virus; PRRSV)는 Arteriviridae에 속하며 전체 유전체는 약 15kb 정도의 양성 단일가닥 RNA 바이러스이다. PRRSV는 유전자형에 따라 크게 두 가지로 구분되며 각각 유럽형(I형)과 북미형(II형)으로 분류하고 있다. 두 가지 유전자형은 비교적 낮은 유전적 유사도를 가지기 때문에 진단이나 예방, 질병 통제에 어려움이 있다. RNA 바이러스의 특성상 종내 변이가 심하고 각 농장마다 발생하는 타입이 상이하거나 복합적으로 발생하기 때문에 현재까지 백신에 의한 예방은 효율성이 떨어지며 농장 오염 방지를 위한 소독이나 청결 유지의 예방만이 최선인 실정이다. 그리고 PRRSV는 돼지의 폐포대식세포를 통해 감염되기 때문에 일단 감염되면 숙주의 면역성을 저하시키고 이로 인한 2차 세균 감염이나 바이러스 감염을 유도하여 질병의 만성화를 일으킨다. 따라서 PRRSV에 대한 좀 더 효율적이고 안정적인 백신의 개발이 필요하다. 이러한 백신 개발을 위해서 PRRSV-숙주간의 다양한 상호작용과 PRRSV의 면역 저해능과 관련된 분자생물학적 연구가 수반되어야 하며 현재 그와 관련된 연구가 활발히 진행되고 있다. 본 연구에서는 돼지생식기호흡기증후군 바이러스의 구조 단백질 중 가장 면역성이 높고 발현량이 많은 뉴클레오캡시드(nucleocapsid; N) 단백질을 PRRSV의 in vivo 숙주 세포인 폐포대식세포에서 안정적으로 발현하는 새로운 세포를 제작하고 이를 통해 N 단백질에 의한 숙주 세포 내 단백질 발현 양상 변화 및 숙주 면역 저하 기작 연구를 수행하였다. 레트로바이러스 유전자 전달시스템(retrovirus mediated gene transfer system)을 이용하여 국내에서 분리된 북미형(II형) 바이러스인 PL97-1의 N 단백질을 발현하는 세포를 만들고 N 단백질의 안정적인 발현을 확인한 다음, 2차원 전기영동법(two-dimensional gel electrophoresis; 2DE)을 통해 보통의 폐포대식세포와 발현 양상이 다른 단백질 15개를 확인하였으며, 이중 발현이 증가된 단백질 4종, 발현이 저하된 단백질 11종과 확인되지 않은 단백질 4종으로 확인 되었다. 이 단백질들은 신진대사(metabolism), 염증반응(inflammation response), 스트레스 반응(stress response), 유비퀴틴 프로테아좀 경로(ubiquitin-proteasome pathway), 단백질 합성, 접힘, 수송에 관계된 단백질로 밝혀졌으며 특히 염증반응, 스트레스 반응, 유비퀴틴 프로테아좀 경로와 같이 면역반응에 관계된 기능도 확인하였다. 최근 PRRSV의 숙주 면역 저하와 관계된 연구들에 의하면 PRRSV의 많은 비구조 단백질(nonstructural protein; nsp)에 의해 숙주 내 항바이러스 시스템인 인터페론의 분비에 저하를 초래한다고 밝혀지고 있다. 하지만 많은 연구들이 nsp를 중심으로 이루어지고 있으며 구조 단백질에 대한 연구는 아직 밝혀지지 않았다, 따라서 본 연구에서는 앞 서 밝혀진 바와 같이 구조 단백질과 숙주내 면역 시스템의 관계도 충분히 확인하기 위해 앞 선 방법과 같이 PRRSV의 구조 단백질 7종을 발현하는 세포를 만들고 이를 통해 인터페론의 저하를 확인하였다, 특히 앞 선 연구에서 밝혀진 바와 같이 N 단백질의 경우 높은 수준의 인터페론 저해능을 확인하였고 좀 더 세부적인 연구를 통해 인터페론 유도 신호기작에서 IRF3를 직접적으로 저해하는 것을 확인하였다. 본 연구는 PRRSV의 구조 단백질인 N 단백질의 세포 내 역할을 좀 더 심도있게 확인한 결과이며 이를 통해 단순히 바이러스의 구조를 이루는 것 뿐만 아니라, 증식을 위해 반드시 숙주가 필요한 바이러스가 적은 단백질을 가지고 어떻게 숙주 내 시스템을 교란하고 이용하는지에 대한 단면이며 PRRSV의 면역 저하와 관련되어 구조 단백질들도 연관이 있다는 것을 밝혀 이를 통해 좀 더 효과적으로 PRRSV에 대한 백신 개발이나 연구에 이용할 수 있을 것으로 판단된다.
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